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第一部分早期ARDS调控巨噬细胞M1极化关键分子的筛选目的:目前已知参与巨噬细胞M1极化的分子诸多,但缺乏在ARDS早期发挥作用的证据。本研究通过高通量实验筛选在ARDS中调控巨噬细胞M1极化的关键分子。方法:（1）本研究为前瞻性、单中心、观察性研究。纳入2017年1月至2017年12月入住我院ICU、年龄大于等于18周岁、符合ARDS柏林定义诊断标准、发病48小时以内的患者。患者入组后记录性别、年龄、主要诊断、ARDS严重程度、急性生理与慢性健康（APACHEⅡ）评分、序贯器官衰竭评分（SOFA）等信息,同时留取外周血标本（入科24小时内）。通过芯片检测全转录组中m RNA的表达量,用于筛选与ARDS严重程度相关的分子。（2）基于GEO公共数据库中人肺泡巨噬细胞极化高通量实验数据,筛选参与巨噬细胞M1极化的候选分子。（3）采用交集分析,筛选既与ARDS严重程度相关又参与巨噬细胞M1极化的候选分子,并通过Hub gene算法确定关键分子。（4）基于GEO公共数据库中巨噬细胞极化高通量实验数据,验证关键分子参与巨噬细胞M1极化。（5）进一步纳入2018年11月至2019年3月的入住东南大学附属中大医院重症医学科的ARDS患者为验证队列研究对象,并纳入非ARDS机械通气患者为对照组。记录患者诊断、ARDS严重程度、性别、年龄等信息,收集患者肺泡灌洗液（BALF）。复制LPS-ARDS小鼠模型,采用q PCR检测关键分子在患者肺泡灌洗液（BALF）和小鼠肺组织中的表达量,进一步验证关键分子参与ARDS发生发展;（6）进一步采用Robust Rank Aggreg算法确定与ARDS和巨噬细胞M1极化相关性最高的关键分子。结果:研究期共纳入32例ARDS患者（轻中重分别为9例、9例和14例）,非ARDS机械通气患者6例。其中26例ARDS患者外周血转录组芯片检测用于ARDS严重程度相关的分子筛选,6例ARDS和6例非ARDS患者BALF用于验证关键分子参与ARDS。（1）ARDS患者外周血转录组芯片筛选出234个分子与严重程度显著正相关（Spearman相关系数0.71,P=0.00006）;（2）GEO公共数据库中人肺泡巨噬细胞极化高通量实验数据筛选出100个分子在M1型巨噬细胞中显著高表达,在M0和M2型巨噬细胞中显著低表达（Log FC>2倍,FDR<0.01）;（3）交集分析确定36个分子既与ARDS严重程度相关又在M1型巨噬细胞中显著高表达;hug gene算法筛选出5个关键分子:干扰素诱导的含有解旋酶C域的蛋白1（IFIH1）、干扰素调节因子1（IRF1）、C-X-C趋化因子10（CXCL10）、干扰素诱导的鸟苷酸结合蛋白1（GBP1）、信号转导与转录激活因子1（STAT1）;（4）对GEO公共数据库中小鼠及人单核-巨噬细胞高通量实验数据分析证实以上5个关键分子均在M1型巨噬细胞中显著高表达,在M0和M2型巨噬细胞中显著低表达（FDR<0.05）;（5）临床和动物实验同时表明:与非ARDS患者相比,ARDS患者的BALF中STAT1、IRF1、GBP1、IFIH1显著高表达（P<0.05）;与假手术小鼠相比,ARDS小鼠肺组织中Ifih1、Irf1、Ifit3、Gbp1和Stat1显著高表达（P<0.05）;（6）Robust Rank Aggreg算法结果提示IFIH1与ARDS严重程度相关性最高（综合P值最小,相关系数最大）。结论:IFIH1可能是ARDS中调控巨噬细胞M1极化的关键分子。第二部分调控IFIH1表达对巨噬细胞M1极化的影响目的:通过调控IFIH1表达量,观察IFIH1对巨噬细胞M1极化的影响。方法:采用LPS和聚肌胞苷酸（Poly I:C）刺激巨噬细胞M1极化,分别通过IFIH1慢病毒干扰序列（sh IFIH1）和IFIH1过表达质粒（IFIH1）,敲低和过表达巨噬细胞系（RAW264.7）和鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）,评估IFIH1对巨噬细胞M1极化的影响。采用q PCR和Western blot检测IFIH1 m RNA和蛋白的表达评估IFIH1敲低和过表达效率。采用流式细胞术检测CD86的表达,采用Western bot检测i NOS的表达,采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测培养基上清液中白细胞介素-1（IL-1）和趋化因子C-C基序趋化因子配体2（CCL2）的表达量。结果:（1）构建IFIH1低表达和过表达RAW264.7细胞系:与转染对照组细胞和RAW264.7细胞相比,sh IFIH1-RAW264.7细胞中IFIH1 m RNA和蛋白的表达量显著降低,P<0.05,IFIH1蛋白的敲低效率为93%。与空白对照组和RAW264.7相比,IFIH1-RAW264.7中IFIH1 m RNA和蛋白的表达量显著升高,P<0.05;IFIH1蛋白的过表达效率为533%。（2）构建IFIH1低表达和过表达BMDMs:与转染对照组BMDMs相比,sh IFIH1-BMDMs中IFIH1 m RNA和蛋白的表达量显著降低,P<0.05;IFIH1蛋白的敲低效率为74%。与空白质粒转染的BMDMs相比,IFIH1-BMDMs中IFIH1 m RNA和蛋白的表达量显著升高,P<0.05;IFIH1蛋白的过表达效率为412%。（3）敲低IFIH1显著减少巨噬细胞M1极化:Western blot分析显示,Poly（I:C）或LPS诱导下,与转染对照组细胞相比,i NOS在sh IFIH1-RAW264.7细胞和sh IFIH1-BMDMs中显著低表达,P<0.05。流式细胞术结果提示,Poly（I:C）或LPS诱导下,CD86在sh IFIH1-RAW264.7细胞和sh IFIH1-BMDMs中显著低表达,P<0.05。ELISA结果提示,Poly（I:C）或LPS诱导下,sh IFIH1-RAW264.7细胞和sh IFIH1-BMDMs分泌IL1β和CCL2的能力显著降低,P<0.05。（4）过表达IFIH1显著增强巨噬细胞M1极化,仅过表达IFIH1不能单独诱导巨噬细胞M1极化:Western blot分析显示,Poly（I:C）或LPS诱导下,与空白质粒转染的巨噬细胞相比,i NOS在IFIH1-RAW264.7细胞和IFIH1-BMDMs中显著高表达,P<0.05。流式细胞术结果提示,Poly（I:C）或LPS诱导下,CD86在IFIH1-RAW264.7细胞和IFIH1-BMDMs中显著高表达,P<0.05。ELISA结果提示,Poly（I:C）或LPS诱导下,IFIH1-RAW264.7细胞和IFIH1-BMDMs分泌IL1β和CCL2的能力显著增强,P<0.05。需要指出的是,仅过表达IFIH1,没有Poly（I:C）或LPS刺激,不能单独诱导巨噬细胞M1极化。结论:IFIH1是巨噬细胞M1极化的调控分子;仅过表达IFIH1,不能单独诱导巨噬细胞M1极化。第三部分MyD88/IFIH1/IRF3调控巨噬细胞M1极化的分子机制目的:探索IFIH1调控巨噬细胞M1极化的分子机制。方法:（1）IFIH1下游分子机制预测:分别基于GEO公共数据库中人肺泡巨噬细胞极化高通量实验数据和人单核起源-巨噬细胞极化高通量实验数据,采用GSEA算法分别预测IFIH1调控肺泡巨噬细胞M1极化和单核-巨噬细胞M1极化的机制,采用交集分析筛选肺泡巨噬细胞M1极化和单核-巨噬细胞M1极化的共同机制。（2）体外实验验证GSEA预测的机制:细胞分组为sh IFIH1-巨噬细胞、sh Ctrl-巨噬细胞、IFIH1-巨噬细胞、Ctrl-巨噬细胞。采用蛋白磷酸化Western blot检测通路中关键蛋白磷酸化程度,采用细胞核/细胞质分离Western blot检测通路中转录因子在细胞核内的表达量,验证GSEA的预测。（3）进一步明确LPS和Poly（I:C）激活IFIH1是否依赖MyD88途径:采用MyD88通路特异性阻断剂ST 2825,评估LPS和Poly（I:C）激活IFIH1是否依赖MyD88途径。细胞分组为:ST 2825-巨噬细胞、Ctrl-巨噬细胞。采用蛋白磷酸化Western blot检测通路中关键蛋白磷酸化程度,采用细胞核/细胞质分离Western blot检测通路中转录因子在细胞核内的表达量。结果:（1）GSEA预测IFIH1下游分子机制:GSEA分析提示,在肺泡巨噬细胞中,IFIH1通过亚麻酸代谢途径、亚油酸代谢途径和RIG-I通路调控巨噬细胞M1极化,FDR<0.05;在单核-巨噬细胞中,IFIH1通过RIG-I通路、TOLL样受体信号通路以及肠免疫网络途径调控巨噬细胞M1极化。交集分析提示RIG-I通路是肺泡巨噬细胞和单核-巨噬细胞M1极化的共同途径。（2）敲低IFIH1对RIG-I通路的影响:相同的LPS或Poly（I:C）诱导下,sh IFIH1-RAW264.7细胞和sh IFIH1-BMDMs中IRF3蛋白磷酸化程度显著降低,细胞核中IRF3蛋白表达量显著降低,P<0.05。单纯慢病毒转染对IRF3蛋白的激活无影响。（3）过表达IFIH1对RIG-I通路的影响:相同的LPS或Poly（I:C）诱导下,IFIH1-RAW264.7细胞和IFIH1-BMDMs中IRF3蛋白磷酸化程度显著增强,细胞核中IRF3蛋白表达丰度显著增加,P<0.05。仅过表达IFIH1,没有LPS或Poly（I:C）刺激,不能单独激活IRF3。（4）进一步验证LPS激活IFIH1-IRF3途径是否依赖MyD88途径:在RAW264.7细胞和BMDMs中,阻断MyD88通路并不影响Poly（I:C）诱导的IRF3磷酸化,但显著降低LPS诱导的IRF3磷酸化,P<0.05。阻断MyD88通路并不影响Poly（I:C）诱导的IRF3入核,但显著降低LPS诱导的IRF3入核,P<0.05。结论:IFIH1通过激活IRF3调控巨噬细胞M1极化,LPS激活IFIH1-IRF3依赖于MyD88途径,Poly（I:C）激活IFIH1-IRF3不依赖于MyD88途径。