论文部分内容阅读
GATA家族是能与核酸共同序列(A/T) GATA(A/G)相结合的转录因子，包括6个成员，即GATA-1，-2，-3，-4，-5，-6。目前研究表明，GATA家族中只有GATA-4和GATA-6在卵巢中共表达，GATA-4与人、小鼠、猪等的卵巢颗粒细胞增殖、分化、凋亡以及卵泡闭锁等关系密切;但有关GATA-6在卵巢中的功能还未知。目前有关探讨GATA-4和GATA-6在鹅卵巢功能的研究还未报道。本文以天府肉鹅母系为试验材料，从分子水平研究了鹅GA TA-4和GA TA-6基因的结构差异性，并检测GA TA-4和GA TA-6 mRNA在三种不同类型的卵泡以及不同等级卵泡中的表达量，探讨GATA-4和GATA-6在卵泡发育中的作用;其次通过构建GA TA-4真核表达载体，培养鹅颗粒细胞，分析过表达GA TA-4基因后，对下游靶基因、类固醇合成、颗粒细胞增殖的影响，初步探讨GATA-4在鹅卵泡颗粒细胞中的作用;最后通过药物25-羟基胆固醇(25-hydroxycholesterol)构建颗粒细胞凋亡模型，分析诱导凋亡后，过表GA TA-4抵制药物对可颗粒细胞凋亡的能力，和平衡药物抑制颗粒细胞生成类固醇的能力，从而验证GATA-4在卵泡发育过程中所发挥的可能作用。主要研究结果如下: (1)通过RT-PCR、克隆测序和序列拼接，获得了鹅GATA-4和GATA-6基因完整编码区序列分别为1236 bp和1104 bp，分别编码411和367个氨基酸，序列号分别为KC454275和KC493562。 (2)生物信息学分析表明，GATA-4和GATA-6均含有锌指结构，GATA-4锌指结构位于氨基酸序列188-275位，GATA-6基因锌指结构位于氨基酸161-248位，两者之间的锌指结构同源性较高，并均含有锌指结构的特殊形(CVNC-X17-CNAC)-X29-(CANC-X17-CNAC)。在线预测和RRXS(T)Y比对分析发现，GATA-4基因在氨基酸序列233(S233)位存在磷酸化位点，该位点与所有物种同源，但是GA TA-6基因不存在磷酸化位点。 (3)在鸟类中，只有斑胸草雀为long-type GATA-6，天府肉鹅、鸡和火鸡均为short-type GATA-6。目前两种形式的GATA-6功能还不清楚。 (4)在三种不同类型卵泡组织中，GATA-4 mRNA在健康卵泡中表达量显著高于闭锁卵泡和排卵后卵泡（P＜0.01）;与之相反，GATA-6 mRNA在健康卵泡中表达量显著低于闭锁卵泡和排卵后卵泡(P＜0.01)。在不同等级卵泡中，GATA-4 mRNA随着卵泡逐渐发育成熟至排卵，其表达量逐渐下降，表达量最高点位于8-10 mm卵泡，最低点位于F1卵泡;同样相反的结果，GATA-6 mRNA随着卵泡发育成熟至排卵，其表达量逐渐升高，表达量最高点位于F1卵泡。推测GATA-4和GATA-6在卵泡发育过程中可能存在相反的作用。 (5)在鹅颗粒细胞中，过表达GA TA-4基因后，与转染组和空白组相比，StAR、Cyp11a1、Cyp19a1和bcl-2 mRNA表达量显著上升数倍（P＜0.01）。BrdU结果表明，过表达GATA-4基因后，颗粒细胞增殖率上升数倍。推测GATA-4能够激活下游靶基因从而间接调控颗粒细胞的增殖分化。 (6)成功构建了25-Hydroxycholesterol诱导颗粒细胞凋亡模型，随处理浓度的增加，类固醇合成通路上的关键基因StAR、Cyp11a1和Cyp19a1 mRNA的表达量均显著下降（P＜0.05）。推测25-Hydroxycholesterol可能通过抑制细胞类固醇合成从而间接调节颗粒细胞的凋亡。 (7)过表达GATA-4基因能够保护25-Hydroxycholesterol对颗粒细胞诱导凋亡和缓解25-Hydroxycholesterol抑制类固醇生成的能力。能够显著地降低caspase-3活性和提高孕酮、雌激素的生成量，以及提高孕酮、雌激素生成关键基因Cyp19a1和3β-HSDmRNA的表达量(P＜0.01)。推测GATA-4在调节颗粒细胞类固醇平衡和抗凋亡方面发挥重要的作用。