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研究背景:生长激素缺乏症(Growth hormone deficiency,GHD)是由于腺垂体前叶合成和(或)分泌生长激素(Growth hormone,GH)完全或部分缺乏而引起的一类内分泌疾病。GHD除了因腺垂体分泌GH缺乏而影响儿童的终身高外,还对一系列的心脏病变如心脏的形态改变、心室结构变化、血管内皮细胞和动脉硬化性心血管疾病具有影响,有研究表明,未经治疗的GHD均伴有不同程度的心血管病变。Ghrelin是一种肽类激素,为生长激素促分泌素受体(Growth hormone secretagogue receptor,GHSR)的内源性配体。它不仅具有促进GH的释放、促进胃肠蠕动、增加食欲、降低血压、抑制炎症因子释放等生物学作用,还具有保护心血管的功能。Ghrelin在体内有两种存在形式:一部分通过酰基转移酶(ghrelin-acyltransferase,GOAT)的催化形成酰基化ghrelin(acyl-ghrelin),另一部分为未经GOAT催化的非酰基化ghrelin(desacyl-ghrelin)。两种形式的ghrelin发挥着不同的心脏保护功能,作用机制亦各不相同。心肌细胞对缺氧损伤的耐受性差,缺氧/缺血会导致心脏电活动异常、心肌细胞凋亡,诱发各类心血管疾病。IGF-1(Insulin like growth factor-1)是一类活性蛋白多肽物质,IGF-1的表达量是衡量心肌细胞和组织正常功能的一个重要指标;另外,AKT被视为一种Ser/Thr蛋白激酶,是PI3K/AKT信号通路的重要组成部分。PI3K/AKT信号通路作为一条经典的信号通路,可通过调控基因表达,在细胞的存活、分化、生长和凋亡等多种生理和病理过程中发挥重要作用。本课题组应用常规超声及3D-STI(Three dimensional speckle tracking Imaging)技术检测GHD患儿的心肌应变能力及结构改变,研究GHD患儿心脏损害程度,分析GHD患儿acyl-ghrelin、desacyl-ghrelin、总ghrelin水平与心脏结构和功能改变的相关性,探讨GH/IGF-1轴对血浆ghrelin水平的调控作用;同时,构建ghrelin慢病毒表达载体,转染至乳鼠心肌细胞及心肌组织,通过免疫荧光、荧光定量PCR、Western Blot、心脏切片免疫组化等方法,验证外源性ghrelin对心肌细胞中GH、GHSR、IGF-1、p-AKT相关蛋白表达的影响及作用机制。第一部分生长激素缺乏症患儿血浆Ghrelin水平变化及其与心脏结构和功能改变的相关性目的:研究GHD发生心脏病变时acyl-ghrelin和desacyl-ghrelin的水平变化;分析、探讨此二种ghrelin的调控机制及对GHD患儿的心脏保护作用。方法:(1)收集35例确诊为GHD的患儿为GHD组,另选取30例健康体检儿童为对照组。经常规二维超声心动图检测GHD组和对照组心脏结构和功能指标如:左室舒张末期后壁厚度(LVPWd),左室舒张末期室间隔厚度(IVSd),左室舒张末期容积(LVPWTd),左室收缩末期容积(LVESV),二维左室射血分数(2D-EF);(2)利用心脏超声三维斑点追踪成像技术(3D-STI)测定GHD组和对照组整体纵向应变(GLS)、整体径向应变(GRS)、整体圆周应变(GCS)、整体扭转角度(GTA)、左室质量(LVM)、左室质量指数(LVMI);(3)ELISA法检测GHD组和对照组外周血acyl-ghrelin、desacyl-ghrelin水平,计算总ghrelin及A/D比值,并采用ELISA法检测GHD组血浆IGF-1水平;(4)应用统计学软件对比分析GHD组和对照组总ghrelin、acyl-ghrelin及desacyl-ghrelin水平及A/D比值;(5)分析GHD组总ghrelin、acyl-ghrelin、desacyl-ghrelin水平、A/D比值与超声心动图及3D-STI测值的相关性;(6)分析GHD组总ghrelin、acyl-ghrelin、desacyl-ghrelin水平、A/D比值与IGF-1水平的相关性;(7)行多元线性回归分析,明确引起acyl-ghrelin和desacyl-ghrelin水平变化的独立危险因素。结果:(1)GHD组与对照组对比:IVSd、LVPWd、LVPEDV、LVESV、2D-EF差异均有统计学意义(P<0.05);(2)GHD组与对照组对比:GLS、GRS、GCS、LVM均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05),GTA对比差异无统计学意义(P>0.05);(3)GHD组的acyl-ghrelin、desacyl-ghrelin、总ghrelin水平及A/D比值均高于对照组,均有统计学差异(P<0.05);(4)GHD组中,acyl-ghrelin、desacyl-ghrelin水平、总ghrelin水平与GLS、GRS、GCS均呈负相关(r=-0.528,P=0.001;r=-0.458,P=0.006;r=-0.369,P=0.029;r=-0.477,P=0.004;r=-0.413,P=0.014;r=-0.334,P=0.050;r=-0.484,P=0.003;r=-0.430,P=0.010;r=-0.353,P=0.038),而与GTA、LVM、IVSd、LVPWd、LVEDV、LVESV、2D-EF均无相关性(P>0.05);A/D比值与GLS、GRS、GCS、GTA、LVM、IVSd、LVPWd、LVEDV、LVESV、2D-EF均无相关性(P>0.05);(5)GHD组中,acyl-ghrelin、desacyl-ghrelin水平、总ghrelin水平与IGF-1水平呈负相关(r=-0.585,P=0.000;r=-0.580,P=0.000;r=-0.589,P=0.000);A/D比值与IGF-1水平无相关性(r=-0.071,P=0.686);(6)行多元线性回归分析,结果显示,IGF-1为acyl-ghrelin和desacyl-ghrelin独立危险因素(B=-4.680,95%CI-8.909～-0.652,P=0.025)和(B=-5.873,95%CI-10.767～-0.979,P=0.021)。结论:(1)GHD患儿存在心脏结构和功能改变,血浆acyl-ghrelin和desacyl-ghrelin水平升高;(2)GHD患儿acyl-ghrelin、desacyl-ghrelin、总ghrelin水平与心脏功能的改变程度相关,但与心脏结构改变不相关。第二部分Ghrelin对心肌细胞缺氧/复氧损伤的修复机制目的:通过缺氧/复氧心肌细胞的ghrelin表达载体实验,研究ghrelin对缺氧/复氧心肌细胞的修复功能,探讨ghrelin保护心脏的具体机制,为其治疗缺氧心肌损伤供理论基础。方法:(1)通过构建ghrelin慢病毒表达载体,采用plvx-puro载体连接ghrelin基因,经过酶切回收和菌落PCR验证表达载体是否构建成功;(2)新生SD大鼠的乳鼠心肌细胞原代分离,采用免疫荧光鉴定是否正确分离心肌细胞,将构建好的ghrelin慢病毒表达载体转染至心肌细胞,并构建心肌细胞缺氧/复氧模型;(3)将转染的心肌细胞分为四组:1)对照组;2)空白组:缺氧/复氧;3)转染组1:表达空载+缺氧/复氧;4)转染组2:ghrelin表达载体+缺氧/复氧。各组进行CCK-8细胞毒性检测,在细胞水平验证ghrelin表达载体对心肌细胞的保护作用;(4)大鼠离体心脏灌注模型的构建,分为四组:1)正常组;2)假手术组(sham组);3)缺氧复氧组;4)ghrelin+缺氧复氧组;(5)荧光定量PCR检测乳鼠心肌细胞及大鼠心肌组织GH、GHSR、IGF-1、AKT的m RNA表达,检测缺氧/复氧心肌组织经ghrelin处理后相关m RNA的表达水平,确定ghrelin对心肌细胞的保护作用;(6)Western Blot检测心肌细胞及大鼠心肌组织GH、GHSR、IGF-1、AKT、p-AKT蛋白的表达水平,通过以上蛋白的表达进一步验证ghrelin的心脏保护功能;(7)大鼠心脏切片免疫组化表征心肌细胞中GH、GHSR、IGF-1、AKT蛋白的表达,通过模型组与ghrelin处理组的对比,揭示ghrelin对心肌细胞的修复作用。结果:(1)成功构建出ghrelin表达载体并转染至乳鼠心肌细胞,通过免疫荧光法鉴定心肌细胞;(2)荧光鉴定检测心肌细胞成活率,转染了ghrelin表达载体后缺氧/复氧模型在24 h、48 h、72 h三个时间段的细胞毒性对比,结果显示:相对于对照组,转染组2(ghrelin表达载体+缺氧/复氧)、转染组1(表达空载+缺氧/复氧)、空白组(缺氧/复氧)细胞成活率均有不同程度降低,差异具有统计学意义(P<0.05),但转染组2相对于空白组及转染组1显示心肌细胞具有一定的修复功能,细胞成活率有所上升(P<0.05);(3)Hoechst染色检测细胞凋亡率显示,空白组和转染组1细胞凋亡率明显增加,显著高于对照组(P<0.01),而ghrelin干预后的转染组2的细胞凋亡率显著低于空白组和转染组1(P<0.01);(4)荧光定量PCR检测心肌细胞显示,空白组和转染组1的GH、GHSR、IGF-1的m RNA表达水平较对照组显著降低(P<0.01);ghrelin干预后,转染组2的GH、GHSR、IGF-1的m RNA表达水平较空白组和转染组1显著升高(P<0.01);(5)心肌细胞Western Blot实验显示,空白组和转染组1的GH、GHSR、IGF-1蛋白表达水平及p-AKT/AKT比值较对照组显著降低(P<0.01),ghrelin干预后,转染组2的GH、GHSR、IGF-1蛋白表达水平及p-AKT/AKT比值较空白组和转染组1显著升高(P<0.01);(6)动物造模荧光定量PCR实验显示,缺氧/复氧组GH、GHSR、IGF-1的m RNA表达水平相较对照组和假手术组显著降低(P<0.01);ghrelin干预后,ghrelin+缺氧/复氧组GH、GHSR、IGF-1的m RNA表达水平较缺氧/复氧组显著升高(P<0.01);(7)动物造模Western Blot实验显示,缺氧/复氧组GH、GHSR、IGF-1的蛋白表达水平及p-AKT/AKT比值较对照组显著降低(P<0.01);ghrelin干预后,即ghrelin+缺氧/复氧组GH、GHSR、IGF-1的蛋白表达水平及p-AKT/AKT比值较缺氧/复氧组显著升高(P<0.01);(8)动物造模大鼠心脏切片的免疫组化分析显示:ghrelin+缺氧/复氧组的GH、GHSR、IGF-1、AKT蛋白表达量明显高于缺氧/复氧组。结论:(1)外源性ghrelin可提高缺氧心肌细胞及组织中GH、GHSR、IGF-1的表达量;(2)ghrelin能抑制心肌细胞凋亡,修复缺氧受损的心肌组织;(3)ghrelin发挥心脏保护功能与GH/IGF-1轴的激活有关;(4)ghrelin可通过激活AMPK途径,抑制蛋白激酶的活性,从而抑制心肌细胞的凋亡,这对ghrelin干预治疗心肌缺氧损伤提供了新思路。