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目的：
1. 分别使用PI3K、mTOR、MEK三个信号通路抑制剂（LY294002、AZD8055、AZD6244）观察胃癌MGC-803细胞增殖、凋亡和周期等生物学活性的改变。2. 观察抑制剂作用于 MGC-803 细胞后 PI3K/Akt/mTOR、Ras/Raf/MEK/ERK 信号通路关键信号分子 mRNA 和蛋白水平的变化，探讨三种抑制剂通过PI3K/Akt/mTOR、Ras/Raf/MEK/ERK 信号通路调控胃癌细胞生物学活性的可能分子机制，进一步阐明胃癌MGC-803细胞中两条信号通路间的补偿性激活及相互调控机制，验证信号通路间存在的反馈环路。
3. 联合应用PI3K抑制剂LY294002和MEK抑制剂AZD6244，mTOR抑制剂AZD8055和MEK抑制剂AZD6244作用于胃癌MC-803细胞，了解三种抑制剂联合作用对胃癌细胞增殖、凋亡、周期和Akt，ERK，P70S6K mRNA及关键蛋白的影响。通过与三种抑制剂单独作用比较，以及 LY294002+AZD6244、AZD8055+AZD6244联用组间的比较，探索出三种不同抑制剂联用的最佳组合方法，阐明PI3K/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的相互作用机制，为寻找新的临床治疗靶向药物，探索新的药物联用治疗方案提供依据。
方法：
1. 应用 PI3K 抑制剂 LY294002，mTOR 抑制剂 AZD8055 和 MEK 抑制剂AZD6244分别作用于胃癌细胞株MGC-803。CCK-8法检测LY294002、AZD8055、AZD6244 对胃癌细胞增殖的影响；流式细胞术检测三种抑制剂分别干预后细胞凋亡率和周期分布变化；RT-qPCR测定三种抑制剂处理后PI3K/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK通路中关键信号分子PI3K、Akt、TSC2、mTOR、P70S6K、RAS、ERK的mRNA表达；Western blot检测三种抑制剂处理后各总蛋白PI3K、Akt、TSC2、mTOR、P70S6K、RAS、ERK 和磷酸化蛋白 p-PI3K、p-Akt、p-TSC2、p-mTOR、p-P70S6K、p-ERK的定量表达。
2. 应用LY294002+AZD6244、AZD8055+AZD6244联合分别干预胃癌细胞株MGC-803。采用CCK-8法检测LY294002+AZD6244、AZD8055+AZD6244联合组对胃癌细胞增殖的影响；Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞术检测LY294002+AZD6244、AZD8055+AZD6244联合组凋亡率和细胞周期分布变化；RT-qPCR测定LY294002+AZD6244、AZD8055+AZD6244联合组PI3K/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK信号通路关键基因Akt、P70S6K、ERK的mRNA表达；Western blot检测各基因Akt、P70S6K、ERK总蛋白和p-Akt、p-P70S6K、p-ERK磷酸化蛋白的定量表达。
结果：
1. 给予不同浓度LY294002干预MGC-803细胞后CCK-8测定结果显示，相比对照组，不同浓度的LY294002对MGC-803细胞呈现出具剂量依赖性的抑制作用，随着 LY294002 浓度的增加MGC-803 的增殖能力逐渐下降（P<0.01）。采用Annexin V-FITC/PI双染法检测LY294002不同浓度组和对照组细胞凋亡率变化，比较不同浓度组凋亡率与对照组凋亡率，实验组凋亡率呈现剂量依赖性增加（P<0.01）。流式细胞术分析了LY294002对细胞周期的影响，与对照组相比较，经不同浓度LY294002处理的细胞G1期细胞比例显著增加（P<0.05）。
2. 采用体外给予AZD8055干预胃癌MGC-803细胞，CCK-8结果显示，相比对照组，不同浓度 AZD8055 对 MGC-803 细胞呈现剂量依赖性抑制作用，随着 AZD8055 浓度增加，MGC-803 细胞增殖能力逐渐下降（P<0.01）。Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞术检测细胞凋亡率，结果显示MGC-803 细胞凋亡率未显现出明显的变化（P>0.05）。流式细胞术结果显示，相比对照组，经不同浓度AZD8055处理的细胞G1，S，G2期细胞比例差别不大（P>0.05）。
3. 应用不同浓度的MEK抑制剂AZD6244处理胃癌细胞MGC-803，CCK-8结果显示，相比对照组，不同浓度 AZD6244 对 MGC-803 细胞呈现剂量依赖性抑制作用，随着AZD6244浓度的增加，MGC-803细胞增殖能力下降（P<0.01）。Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞术检测细胞凋亡情况，25、125、175μmol/L浓度组凋亡率均高于对照组（P<0.05）。流式细胞术结果显示，相比对照组，经不同浓度AZD6244处理的细胞G1 期细胞比例显著增加（P<0.05），S期细胞比例减少（P<0.05）。
4. RT-qPCR结果显示，LY294002作用48 h后，实验组的PI3K，TSC2， P70S6K的 mRNA表达量呈剂量依赖性下降（P＜0.05），mTOR表达量高于对照组但随抑制剂浓度逐渐降低（P＜0.05），ERK表达没有出现明显的变化（P>0.05）。同时LY294002作用24h后Western Blot结果显示，与对照组相比，P-PI3K，P-Akt， P-mTOR，P-P70S6K蛋白表达量呈剂量依赖性下降，P-TSC2表达先升高后下降， P-ERK随着抑制剂浓度的增加蛋白表达量逐渐升高（P＜0.05）。通路中总蛋白PI3K，AKT，mTOR，TSC2，P70S6K，RAS表达量随着抑制剂浓度的增加而降低（P＜0.05），ERK表达量未见明显改变（P>0.05）。
5. RT-qPCR结果显示，AZD8055作用48 h后，实验组的mTOR，P70S6K， RAS的 mRNA表达量降低，其中mTOR表达量呈浓度依赖性下降趋势（P＜0.05）， Akt，TSC2的 mRNA表达量随浓度增加呈上升趋势（P＜0.05），ERK表达没有出现明显的变化（P>0.05）。同时AZD8055作用24 h后Western Blot结果显示，与对照组相比，p-mTOR，p-TSC2，p-P70S6K蛋白表达量呈剂量依赖性下降（P＜0.05），p-PI3K，p-Akt蛋白表达量随抑制剂浓度增加逐渐升高（P＜0.05），p-ERK的蛋白表达量先升高后降低（P＜0.05）。通路中总蛋白PI3K，Akt，mTOR，TSC2， P70S6K，RAS，ERK 表达量未见明显改变（P>0.05）。
6. RT-qPCR结果显示，AZD6244作用48 h后，实验组的PI3K，TSC2，P70S6K的 mRNA表达量呈浓度依赖性上升趋势（P＜0.05），RAS，ERK的mRNA表达量随 AZD6244 浓度增加呈下降趋势（P＜0.05）。同时 AZD6244 作用 24 h 后Western blot结果显示，与对照组相比，p-PI3K，p-Akt，p-mTOR，p-P70S6K蛋白表达量呈剂量依赖性上的上升（P＜0.05），P-TSC2 蛋白表达量先升高后降低（P＜0.05），p-ERK蛋白表达量随着抑制剂浓度增加而降低（P＜0.05）。通路中总蛋白PI3K，Akt，mTOR，P70S6K，ERK 表达量未见明显改变（P>0.05），TSC2蛋白表达量随抑制剂浓度增加而逐渐降低（P＜0.05），RAS蛋白表达量随着抑制剂浓度增加而逐渐升高（P＜0.05）。
7. (12.5、15、20、25、30、50、75、100)μmol/L LY294002、(5、10、25 35、40、80、100)nmol/L AZD8055、(5、12.5、25、50、125、175、250、300)μmol/LAZD6244单独及联合作用于MGC-803细胞，结果显示，不同浓度LY294002和AZD6244联用对MGC-803细胞均有抑制作用，且随着联用抑制剂浓度的增加，MGC-803细胞增殖能力呈剂量依赖性下降（P<0.01）；不同浓度AZD8055和AZD6244联用对MGC-803细胞均有抑制作用，且随着联用抑制剂浓度的增加，MGC-803 细胞增殖能力呈剂量依赖性下降（P<0.01）。进一步分析可知，LY294002+AZD6244联合组胃癌细胞的增殖率低于LY294002、AZD6244单独作用组，AZD8055+AZD6244联合组胃癌细胞的增殖率低于AZD8055、AZD6244单独作用组。
8. 流式细胞术检测各组细胞凋亡率变化，不同浓度LY294002、AZD8055、AZD6244单独及联合作用于MGC-803细胞，结果显示，不同浓度LY294002和AZD6244联用对 MGC-803 细胞均有诱导凋亡的作用，且随着联用浓度的增加，诱导 MGC-803 细胞凋亡能力逐渐提高，诱导作用呈剂量依赖性（P<0.01）；不同浓度AZD8055和 AZD6244联用对 MGC-803 细胞同样存在诱导凋亡的作用，且随着联用浓度的增加，诱导MGC-803 细胞凋亡能力逐渐提高，诱导作用呈现剂量依赖性（P<0.01）。进一步分析可知， LY294002+AZD6244联合组诱导胃癌细胞凋亡的程度高于LY294002、AZD6244单独作用组，AZD8055+AZD6244联合组诱导胃癌细胞的凋亡程度高于 AZD8055、AZD6244 单独作用组，同时LY294002+AZD6244 联合组诱导胃癌细胞的凋亡程度高于 AZD8055+AZD6244联合组。
9. 流式细胞术检测各浓度组细胞周期分布，结果显示， LY294002 与AZD6244合用后，与对照组相比，G1期细胞数显著增加，S期细胞数减少（P<0.05），联合组对细胞G1期的阻滞作用显著强于LY294002、AZD6244单独给药组。单用AZD8055对胃癌MGC-803细胞的细胞周期分布无明显影响，但AZD6244诱导 G0/G1 期细胞周期阻滞，G1 期显著增加，S 期细胞周期减少。AZD8055 与AZD6244合用后，与对照组相比，G1期细胞数显著增加（P<0.05），S期细胞数减少（P<0.05），但联合作用并未显示出比单独作用更强的阻滞细胞周期的作用。
10. 实时荧光定量PCR检测LY294002、AZD8055、AZD6244联合用药作用MGC-803细胞48 h后显示，不同浓度LY294002和AZD6244联合作用处理MGC-803细胞中信号通路关键基因Akt，P70S65K，ERK的mRNA表达发生明显改变， Akt，P70S6K，ERK的mRNA的表达量呈浓度依赖性下降趋势（P＜0.05）。不同浓度AZD8055和AZD6244联合作用后，信号通路关键基因Akt， P70S65K，ERK的mRNA表达发生明显改变，随着联合作用抑制剂浓度的升高， Akt，P70S6K，ERK的mRNA的表达量逐渐下降（P＜0.05）。Western blot检测结果显示，LY294002、AZD8055、AZD6244单独处理、LY294002+AZD6244、AZD8055+AZD6244联合处理胃癌MGC-803细胞后，Akt、P70S6K和ERK的总蛋白表达未见明显改变（P>0.05）。LY294002+AZD6244、AZD8055+AZD6244联合处理MGC-803细胞后通路磷酸化蛋白p-Akt，p-P70S6K，p-ERK蛋白表达量低于对照组及LY294002，AZD8055，AZD6244单独作用组（P＜0.05），联合用药组相比单独用药组具有较强抑制各关键磷酸化蛋白的作用。并且LY294002+AZD6244组使p-Akt，p-P70S6K，p-ERK的下降程度比AZD8055+AZD6244组明显。
结论：
1. 抑制剂LY294002，AZD6244显示出抑制胃癌细胞MGC-803增殖，诱导胃癌细胞凋亡，阻滞细胞周期的作用；抑制剂AZD8055只显示出对胃癌细胞的增殖有显著的抑制作用，但对细胞凋亡以及细胞周期的影响不显著。
2. LY294002通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路关键信号分子以降低胃癌细胞增殖率、提高胃癌细胞凋亡率、改变细胞周期比例；mTOR抑制剂AZD8055抑制 PI3K/Akt/mTOR 通路关键信号分子的转录和翻译，进一步抑制 MGC-803细胞的增殖；MEK抑制剂AZD6244抑制 Ras/Raf/MEK/ERK通路关键信号分子的转录和翻译，通过MEK/ERK及下游关键因子的变化调控胃癌细胞的生物学功能。因此LY294002，AZD8055，AZD6244可以通过对PI3K/Akt/mTOR、Ras/Raf/MEK/ERK信号通路产生影响，进一步改变胃癌细胞的生物学活性。
3. LY294002作用于胃癌MGC-803细胞证明了PI3K/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK信号通路间存在代偿性激活，推测在胃癌MGC-803细胞中mTOR活性受到抑制后，通过P70S6K-PI3K-RAS的反馈调节，激活Ras/Raf/MEK/ERK信号通路。AZD8055作用于胃癌MGC-803细胞，对PI3K/Akt/mTOR信号通路产生抑制作用，一条信号通路的抑制可能通过通路间补偿作用机制引起另一通路的激活，显示出Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的激活状态，同时表明下游信号通路的抑制导致上游信号分子PI3K，Akt的反馈性激活。研究显示出胃癌MGC-803细胞中PI3K-Akt-TSC2-mTOR的信号传导途径的存在，也推测Ras/Raf/MEK/ERK 途径通过调节PI3K，TSC2和mTOR交叉激活PI3K/Akt/mTOR信号传导。AZD6244作用于胃癌MGC-803细胞后，AZD6244使Ras/Raf/MEK/ERK信号通路下游通路抑制，同时显示出PI3K/Akt/mTOR信号通路的反馈激活状态，研究显示Ras-ERK途径通过调节PI3K，TSC2和mTOR交叉激活PI3K-mTOR信号传导，ERK抑制导致TSC2去磷酸化，抑制TSC2并进一步激活mTOR。显示出PI3K/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK信号通路间的代偿性激活状态，及PI3K/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK两条信号通路间具体的反馈作用机制。
4. LY294002+AZD6244，AZD8055+AZD6244 联合运用抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，诱导细胞周期阻滞，显著抑制两条信号通路关键信号分子 Akt、P70S6K 和 ERK 的转录和翻译过程。LY294002+AZD6244 联合运用相比较两种抑制剂单独作用显示出更强的抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，诱导细胞周期阻滞的作用；AZD8055+AZD6244 联合作用相比较两种抑制剂单独作用显示出较强的抑制细胞增殖作用，但并未显示出比单独作用更强的诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期的作用。LY294002+AZD6244联合组抑制胃癌细胞增殖、诱导胃癌细胞凋亡的程度强于 AZD8055+AZD6244 联合组。联合用药组抑制各关键磷酸化蛋白的程度强于单独用药组，LY294002+AZD6244组使p-Akt，p-P70S6K，p-ERK的下降程度比 AZD8055+AZD6244 组更加明显，本研究为寻找新的有效治疗胃癌的靶向药物和提出新的药物联合方式提供实验依据。
1. 分别使用PI3K、mTOR、MEK三个信号通路抑制剂（LY294002、AZD8055、AZD6244）观察胃癌MGC-803细胞增殖、凋亡和周期等生物学活性的改变。2. 观察抑制剂作用于 MGC-803 细胞后 PI3K/Akt/mTOR、Ras/Raf/MEK/ERK 信号通路关键信号分子 mRNA 和蛋白水平的变化，探讨三种抑制剂通过PI3K/Akt/mTOR、Ras/Raf/MEK/ERK 信号通路调控胃癌细胞生物学活性的可能分子机制，进一步阐明胃癌MGC-803细胞中两条信号通路间的补偿性激活及相互调控机制，验证信号通路间存在的反馈环路。
3. 联合应用PI3K抑制剂LY294002和MEK抑制剂AZD6244，mTOR抑制剂AZD8055和MEK抑制剂AZD6244作用于胃癌MC-803细胞，了解三种抑制剂联合作用对胃癌细胞增殖、凋亡、周期和Akt，ERK，P70S6K mRNA及关键蛋白的影响。通过与三种抑制剂单独作用比较，以及 LY294002+AZD6244、AZD8055+AZD6244联用组间的比较，探索出三种不同抑制剂联用的最佳组合方法，阐明PI3K/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的相互作用机制，为寻找新的临床治疗靶向药物，探索新的药物联用治疗方案提供依据。
方法：
1. 应用 PI3K 抑制剂 LY294002，mTOR 抑制剂 AZD8055 和 MEK 抑制剂AZD6244分别作用于胃癌细胞株MGC-803。CCK-8法检测LY294002、AZD8055、AZD6244 对胃癌细胞增殖的影响；流式细胞术检测三种抑制剂分别干预后细胞凋亡率和周期分布变化；RT-qPCR测定三种抑制剂处理后PI3K/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK通路中关键信号分子PI3K、Akt、TSC2、mTOR、P70S6K、RAS、ERK的mRNA表达；Western blot检测三种抑制剂处理后各总蛋白PI3K、Akt、TSC2、mTOR、P70S6K、RAS、ERK 和磷酸化蛋白 p-PI3K、p-Akt、p-TSC2、p-mTOR、p-P70S6K、p-ERK的定量表达。
2. 应用LY294002+AZD6244、AZD8055+AZD6244联合分别干预胃癌细胞株MGC-803。采用CCK-8法检测LY294002+AZD6244、AZD8055+AZD6244联合组对胃癌细胞增殖的影响；Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞术检测LY294002+AZD6244、AZD8055+AZD6244联合组凋亡率和细胞周期分布变化；RT-qPCR测定LY294002+AZD6244、AZD8055+AZD6244联合组PI3K/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK信号通路关键基因Akt、P70S6K、ERK的mRNA表达；Western blot检测各基因Akt、P70S6K、ERK总蛋白和p-Akt、p-P70S6K、p-ERK磷酸化蛋白的定量表达。
结果：
1. 给予不同浓度LY294002干预MGC-803细胞后CCK-8测定结果显示，相比对照组，不同浓度的LY294002对MGC-803细胞呈现出具剂量依赖性的抑制作用，随着 LY294002 浓度的增加MGC-803 的增殖能力逐渐下降（P<0.01）。采用Annexin V-FITC/PI双染法检测LY294002不同浓度组和对照组细胞凋亡率变化，比较不同浓度组凋亡率与对照组凋亡率，实验组凋亡率呈现剂量依赖性增加（P<0.01）。流式细胞术分析了LY294002对细胞周期的影响，与对照组相比较，经不同浓度LY294002处理的细胞G1期细胞比例显著增加（P<0.05）。
2. 采用体外给予AZD8055干预胃癌MGC-803细胞，CCK-8结果显示，相比对照组，不同浓度 AZD8055 对 MGC-803 细胞呈现剂量依赖性抑制作用，随着 AZD8055 浓度增加，MGC-803 细胞增殖能力逐渐下降（P<0.01）。Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞术检测细胞凋亡率，结果显示MGC-803 细胞凋亡率未显现出明显的变化（P>0.05）。流式细胞术结果显示，相比对照组，经不同浓度AZD8055处理的细胞G1，S，G2期细胞比例差别不大（P>0.05）。
3. 应用不同浓度的MEK抑制剂AZD6244处理胃癌细胞MGC-803，CCK-8结果显示，相比对照组，不同浓度 AZD6244 对 MGC-803 细胞呈现剂量依赖性抑制作用，随着AZD6244浓度的增加，MGC-803细胞增殖能力下降（P<0.01）。Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞术检测细胞凋亡情况，25、125、175μmol/L浓度组凋亡率均高于对照组（P<0.05）。流式细胞术结果显示，相比对照组，经不同浓度AZD6244处理的细胞G1 期细胞比例显著增加（P<0.05），S期细胞比例减少（P<0.05）。
4. RT-qPCR结果显示，LY294002作用48 h后，实验组的PI3K，TSC2， P70S6K的 mRNA表达量呈剂量依赖性下降（P＜0.05），mTOR表达量高于对照组但随抑制剂浓度逐渐降低（P＜0.05），ERK表达没有出现明显的变化（P>0.05）。同时LY294002作用24h后Western Blot结果显示，与对照组相比，P-PI3K，P-Akt， P-mTOR，P-P70S6K蛋白表达量呈剂量依赖性下降，P-TSC2表达先升高后下降， P-ERK随着抑制剂浓度的增加蛋白表达量逐渐升高（P＜0.05）。通路中总蛋白PI3K，AKT，mTOR，TSC2，P70S6K，RAS表达量随着抑制剂浓度的增加而降低（P＜0.05），ERK表达量未见明显改变（P>0.05）。
5. RT-qPCR结果显示，AZD8055作用48 h后，实验组的mTOR，P70S6K， RAS的 mRNA表达量降低，其中mTOR表达量呈浓度依赖性下降趋势（P＜0.05）， Akt，TSC2的 mRNA表达量随浓度增加呈上升趋势（P＜0.05），ERK表达没有出现明显的变化（P>0.05）。同时AZD8055作用24 h后Western Blot结果显示，与对照组相比，p-mTOR，p-TSC2，p-P70S6K蛋白表达量呈剂量依赖性下降（P＜0.05），p-PI3K，p-Akt蛋白表达量随抑制剂浓度增加逐渐升高（P＜0.05），p-ERK的蛋白表达量先升高后降低（P＜0.05）。通路中总蛋白PI3K，Akt，mTOR，TSC2， P70S6K，RAS，ERK 表达量未见明显改变（P>0.05）。
6. RT-qPCR结果显示，AZD6244作用48 h后，实验组的PI3K，TSC2，P70S6K的 mRNA表达量呈浓度依赖性上升趋势（P＜0.05），RAS，ERK的mRNA表达量随 AZD6244 浓度增加呈下降趋势（P＜0.05）。同时 AZD6244 作用 24 h 后Western blot结果显示，与对照组相比，p-PI3K，p-Akt，p-mTOR，p-P70S6K蛋白表达量呈剂量依赖性上的上升（P＜0.05），P-TSC2 蛋白表达量先升高后降低（P＜0.05），p-ERK蛋白表达量随着抑制剂浓度增加而降低（P＜0.05）。通路中总蛋白PI3K，Akt，mTOR，P70S6K，ERK 表达量未见明显改变（P>0.05），TSC2蛋白表达量随抑制剂浓度增加而逐渐降低（P＜0.05），RAS蛋白表达量随着抑制剂浓度增加而逐渐升高（P＜0.05）。
7. (12.5、15、20、25、30、50、75、100)μmol/L LY294002、(5、10、25 35、40、80、100)nmol/L AZD8055、(5、12.5、25、50、125、175、250、300)μmol/LAZD6244单独及联合作用于MGC-803细胞，结果显示，不同浓度LY294002和AZD6244联用对MGC-803细胞均有抑制作用，且随着联用抑制剂浓度的增加，MGC-803细胞增殖能力呈剂量依赖性下降（P<0.01）；不同浓度AZD8055和AZD6244联用对MGC-803细胞均有抑制作用，且随着联用抑制剂浓度的增加，MGC-803 细胞增殖能力呈剂量依赖性下降（P<0.01）。进一步分析可知，LY294002+AZD6244联合组胃癌细胞的增殖率低于LY294002、AZD6244单独作用组，AZD8055+AZD6244联合组胃癌细胞的增殖率低于AZD8055、AZD6244单独作用组。
8. 流式细胞术检测各组细胞凋亡率变化，不同浓度LY294002、AZD8055、AZD6244单独及联合作用于MGC-803细胞，结果显示，不同浓度LY294002和AZD6244联用对 MGC-803 细胞均有诱导凋亡的作用，且随着联用浓度的增加，诱导 MGC-803 细胞凋亡能力逐渐提高，诱导作用呈剂量依赖性（P<0.01）；不同浓度AZD8055和 AZD6244联用对 MGC-803 细胞同样存在诱导凋亡的作用，且随着联用浓度的增加，诱导MGC-803 细胞凋亡能力逐渐提高，诱导作用呈现剂量依赖性（P<0.01）。进一步分析可知， LY294002+AZD6244联合组诱导胃癌细胞凋亡的程度高于LY294002、AZD6244单独作用组，AZD8055+AZD6244联合组诱导胃癌细胞的凋亡程度高于 AZD8055、AZD6244 单独作用组，同时LY294002+AZD6244 联合组诱导胃癌细胞的凋亡程度高于 AZD8055+AZD6244联合组。
9. 流式细胞术检测各浓度组细胞周期分布，结果显示， LY294002 与AZD6244合用后，与对照组相比，G1期细胞数显著增加，S期细胞数减少（P<0.05），联合组对细胞G1期的阻滞作用显著强于LY294002、AZD6244单独给药组。单用AZD8055对胃癌MGC-803细胞的细胞周期分布无明显影响，但AZD6244诱导 G0/G1 期细胞周期阻滞，G1 期显著增加，S 期细胞周期减少。AZD8055 与AZD6244合用后，与对照组相比，G1期细胞数显著增加（P<0.05），S期细胞数减少（P<0.05），但联合作用并未显示出比单独作用更强的阻滞细胞周期的作用。
10. 实时荧光定量PCR检测LY294002、AZD8055、AZD6244联合用药作用MGC-803细胞48 h后显示，不同浓度LY294002和AZD6244联合作用处理MGC-803细胞中信号通路关键基因Akt，P70S65K，ERK的mRNA表达发生明显改变， Akt，P70S6K，ERK的mRNA的表达量呈浓度依赖性下降趋势（P＜0.05）。不同浓度AZD8055和AZD6244联合作用后，信号通路关键基因Akt， P70S65K，ERK的mRNA表达发生明显改变，随着联合作用抑制剂浓度的升高， Akt，P70S6K，ERK的mRNA的表达量逐渐下降（P＜0.05）。Western blot检测结果显示，LY294002、AZD8055、AZD6244单独处理、LY294002+AZD6244、AZD8055+AZD6244联合处理胃癌MGC-803细胞后，Akt、P70S6K和ERK的总蛋白表达未见明显改变（P>0.05）。LY294002+AZD6244、AZD8055+AZD6244联合处理MGC-803细胞后通路磷酸化蛋白p-Akt，p-P70S6K，p-ERK蛋白表达量低于对照组及LY294002，AZD8055，AZD6244单独作用组（P＜0.05），联合用药组相比单独用药组具有较强抑制各关键磷酸化蛋白的作用。并且LY294002+AZD6244组使p-Akt，p-P70S6K，p-ERK的下降程度比AZD8055+AZD6244组明显。
结论：
1. 抑制剂LY294002，AZD6244显示出抑制胃癌细胞MGC-803增殖，诱导胃癌细胞凋亡，阻滞细胞周期的作用；抑制剂AZD8055只显示出对胃癌细胞的增殖有显著的抑制作用，但对细胞凋亡以及细胞周期的影响不显著。
2. LY294002通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路关键信号分子以降低胃癌细胞增殖率、提高胃癌细胞凋亡率、改变细胞周期比例；mTOR抑制剂AZD8055抑制 PI3K/Akt/mTOR 通路关键信号分子的转录和翻译，进一步抑制 MGC-803细胞的增殖；MEK抑制剂AZD6244抑制 Ras/Raf/MEK/ERK通路关键信号分子的转录和翻译，通过MEK/ERK及下游关键因子的变化调控胃癌细胞的生物学功能。因此LY294002，AZD8055，AZD6244可以通过对PI3K/Akt/mTOR、Ras/Raf/MEK/ERK信号通路产生影响，进一步改变胃癌细胞的生物学活性。
3. LY294002作用于胃癌MGC-803细胞证明了PI3K/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK信号通路间存在代偿性激活，推测在胃癌MGC-803细胞中mTOR活性受到抑制后，通过P70S6K-PI3K-RAS的反馈调节，激活Ras/Raf/MEK/ERK信号通路。AZD8055作用于胃癌MGC-803细胞，对PI3K/Akt/mTOR信号通路产生抑制作用，一条信号通路的抑制可能通过通路间补偿作用机制引起另一通路的激活，显示出Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的激活状态，同时表明下游信号通路的抑制导致上游信号分子PI3K，Akt的反馈性激活。研究显示出胃癌MGC-803细胞中PI3K-Akt-TSC2-mTOR的信号传导途径的存在，也推测Ras/Raf/MEK/ERK 途径通过调节PI3K，TSC2和mTOR交叉激活PI3K/Akt/mTOR信号传导。AZD6244作用于胃癌MGC-803细胞后，AZD6244使Ras/Raf/MEK/ERK信号通路下游通路抑制，同时显示出PI3K/Akt/mTOR信号通路的反馈激活状态，研究显示Ras-ERK途径通过调节PI3K，TSC2和mTOR交叉激活PI3K-mTOR信号传导，ERK抑制导致TSC2去磷酸化，抑制TSC2并进一步激活mTOR。显示出PI3K/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK信号通路间的代偿性激活状态，及PI3K/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK两条信号通路间具体的反馈作用机制。
4. LY294002+AZD6244，AZD8055+AZD6244 联合运用抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，诱导细胞周期阻滞，显著抑制两条信号通路关键信号分子 Akt、P70S6K 和 ERK 的转录和翻译过程。LY294002+AZD6244 联合运用相比较两种抑制剂单独作用显示出更强的抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，诱导细胞周期阻滞的作用；AZD8055+AZD6244 联合作用相比较两种抑制剂单独作用显示出较强的抑制细胞增殖作用，但并未显示出比单独作用更强的诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期的作用。LY294002+AZD6244联合组抑制胃癌细胞增殖、诱导胃癌细胞凋亡的程度强于 AZD8055+AZD6244 联合组。联合用药组抑制各关键磷酸化蛋白的程度强于单独用药组，LY294002+AZD6244组使p-Akt，p-P70S6K，p-ERK的下降程度比 AZD8055+AZD6244 组更加明显，本研究为寻找新的有效治疗胃癌的靶向药物和提出新的药物联合方式提供实验依据。