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第一部分NT-4及其受体TrkB与新生大鼠脑出血的相关性研究目的:研究新生儿生发基质出血(Germinal Matrix Hemorrhage,GMH,新生儿脑出血)模型中,神经营养因子4(Neurotrophin-4,NT-4),原肌凝蛋白受体激酶B(Tropomyosin receptor kinase B,TrkB),在损伤后不同时间点的水平变化。方法:1.随机选取6只体重在12-14g之间的新生儿Sprague-Dawley(SD)大鼠幼崽作对照组(Naive)处理,另取30只体重在12-14g之间的新生儿SD大鼠幼崽制备新生儿脑出血模型(Germinal Matrix Hemorrhage,GMH),按发生脑出血之后12 h,1 day,3 day,5day,7 day平均分为5组,每组6只。建立GMH模型后新生儿SD大鼠幼崽若死亡则随机选取大鼠幼崽造模以补足每组大鼠数量。2.每组存活新生儿SD大鼠幼崽在相对应的时间点用异氟烷麻醉后处死,取双侧大脑半球脑组织,用蛋白质免疫印迹实验(Western blot,WB)检测NT-4,TrkB,以及磷酸化后激活态TrkB(p-TrkB)在发生GMH之后不同时间点的蛋白质表达水平变化。结果:1.内源性NT-4蛋白表达水平在GMH发生后12小时及1天明显下降,第3天时有所回升,然后在第5,7天逐渐恢复至正常水平。2.TrkB水平在GMH后未发现明显改变,而磷酸化的TrkB水平在GMH发生后显著升高,在第3天达到高峰,且维持高水平表达至第7天。结论:1.GMH后NT-4/TrkB通路将会被激活,从而发挥某种作用从而减轻急性出血所引起的脑损伤。2.GMH发生后内源性NT-4可能被消耗,继而使TrkB磷酸化来对下游相关通路进行调控。第二部分探究外源性NT-4给药对新生儿大鼠GMH后脑损伤的影响目的:探究在GMH发生后,外源性NT-4给药对新生儿大鼠脑损伤程度的影响。确认外源性NT-4经鼻给药途径的合理及有效性。验证TrkB在不同神经细胞中的表达。方法:1.随机选取30只体重在12-14g之间的新生儿Sprague-Dawley(SD)大鼠幼崽平均分为假手术组(sham),GMH溶剂对照组(GMH+Vehicle),NT-4低剂量治疗组(NT-4 Low Dose),NT-4中剂量治疗组(NT-4 Medium Dose),NT-4高剂量治疗组(NT-4High Dose),共5组,每组6只。Sham组在行手术时往脑组织中注入3微升无菌生理盐水,其他4组在手术时均注入3微升梭菌属的胶原酶VII-S(clostridial collagenase VII-S)从而导致GMH发生。不同剂量的NT-4稀释于5%DMSO的生理盐水中,剂量分别为0.03mg/kg/day,0.1mg/kg/day及0.3mg/kg/day。给药方式均为经鼻给药,给药时间以GMH发生后1小时开始计算,每日一次,连续给药7天。建立GMH模型后新生儿SD大鼠幼崽若死亡则随机选取大鼠幼崽造模以补足每组大鼠数量。2.GMH发生后3天内以双盲标准对大鼠幼崽重新随机编号,进行短期行为学测试(Short-term Behavior Test),包括正位反射(righting reflex test)和负趋地性试验(negative geotaxis test)。从3天短期的行为学测试中对所得数据进行分析,探究给药组与GMH组是否存在行为学差异,并从不同剂量给药组中找出最优剂量组,从而指导长期行为学测试方向。3.另外随机选取18只体重在12-14g之间的新生儿Sprague-Dawley(SD)大鼠幼崽随机分为Sham组、GMH+Vehicle组及NT-4最佳剂量组,将该三组模型补足至12只/组,并于GMH发生后21-28天进行长期行为学测试(Long-term Behavior Test),包括步误测试(foot-fault test),滚轮测试(rotarodtest)和水迷宫测试(watermaze test),从而观察Sham组、GMH+Vehicle组及NT-4治疗组的长期行为学差异。进行长期行为学后的大鼠用异氟烷麻醉后处死,取全部脑组织用4%的福尔马林固定后,用30%高渗糖水脱水后,行尼氏染色,分析不同组别大鼠脑组织形态学变化。4.随机选取6只体重在12-14g之间的新生儿Sprague-Dawley(SD)大鼠幼崽进行GMH造模,3天后处死取全脑固定标本,行免疫荧光实验,探究TrkB与大鼠神经系统内三种主要细胞神经元细胞(Neuron),小胶质细胞(Microglia),星形胶质细胞(Astrocyte)的共定位关系。另外随机选取18只体重在12-14g之间的新生儿Sprague-Dawley(SD)大鼠幼崽分为Sham组、GMH+Vehicle组及NT-4最佳剂量组,3天后处死取双侧大脑半球脑组织行WB实验,明确外源性NT-4经鼻给药途径的可行性。结果:1.GMH后3天内短期行为学测试提示GMH+Vehicle组的行为学表现较Sham组有明显退步,低剂量NT-4给药组与GMH+Vehicle组行为学表现相比无明显统计学差异,而中、高剂量给药组与GMH+Vehicle组行为学相比有明显进步。这种差异在GMH发生后的三天内逐渐变小。2.GMH后第21-28天行为学提示GMH+Vehicle组的长期行为学表现较Sham组有明显退步,中剂量NT-4给药组与GMH+Vehicle组行为学相比有明显进步,且中剂量NT-4给药组与Sham组长期行为学结果相比差异不大。说明就中剂量NT-4给药来说减轻了 GMH后的脑损伤,改善了 GMH大鼠的认知功能。3.WB实验结果显示在Sham及GMH+Vehicle组的脑组织重中未能发现重组人NT-4(rh-NT-4)的表达,而在给药组中可发现重组人NT-4的表达明显升高,说明NT-4经鼻给药可跨过血脑屏障,直接进入脑组织中发挥效能。4.免疫荧光实验结果显示NT-4的特异性受体TrkB在神经元、小胶质细胞及星形胶质细胞中均有表达。5.根据尼氏染色实验结果,我们从脑室容积、相对灰质厚度、相对白质区域、相对灰质区域四个方面的数据分析可以得出:GMH后脑室容积相对Sham组有明显的扩张,相对绘灰质厚度变薄,相对灰质、白质区域均减少,而在NT-4治疗后,可见大鼠脑室容积较GMH组有明显缩小,灰质及白质区域均有明显回升。第三部分探究在GMH模型下NT-4,TrkB及其下游通路PI3K/Akt/FoxO1与神经炎症的相关性目的:探究在GMH模型中NT-4,TrkB及其可能的下游通路PI3K/Akt/FoxO1与神经炎症的相关性。方法:1.随机选取54只体重在12-14g之间的新生儿Sprague-Dawley(SD)大鼠幼崽平均分为假手术组(sham),GMH溶剂对照组(GMH+Vehicle),NT-4治疗组,NT-4治疗+ANA-12干预组,NT-4治疗+ANA-12溶剂对照组,NT-4治疗+LY294002干预组,NT-4治疗+LY294002溶剂对照组,NT-4治疗+FoxO1 CRISPR干预组,NT-4治疗+FoxO1 CRISPR溶剂对照组,共9组,每组6只。ANA-12为TrkB选择性抑制剂,溶于5%DMSO生理盐水中,以0.5mg/kg剂量给药,给药方式为GMH发生对侧侧脑室内注射,给药时间为GMH发生前1h,ANA-12对照组为对侧侧脑室内注射生理盐水。LY-294002为PI3K/Akt选择性抑制剂,溶于5%DMSO生理盐水中,给药方式为GMH发生对侧侧脑室内注射,给药时间为GMH发生前1h,LY-294002对照组为对侧侧脑室内注射生理盐水。FoxO1 CRISPR为一种质粒转染介质,给药方式为GMH发生对侧侧脑室内注射,给药时间为GMH发生前1h,FoxO1 CRISPR对照组为对侧侧脑室内注射CRISPR转染试剂溶剂。2.除假手术组及GMH溶剂对照组外,其他各组均予外源性NT-4经鼻给药治疗3天,剂量为0.1mg/kg/day,3天后予异氟烷麻醉后处死,取双侧大脑半球脑组织用于WB实验。结果:1.在GMH溶剂对照组中,磷酸化的TrkB稍有增加,其下游因子PI3K和磷酸化的Akt减少。与假手术组相比,FoxO1和IL-6升高。而经过外源性NT-4给药后,磷酸化的TrkB较溶剂对照组明显升高,PI3K和磷酸化的Akt的表达升高至与sham组相似的基础水平。下游因子FoxO1、IL-6也较溶剂对照组下降。因此,外源性NT-4治疗可能能够抑制炎性细胞因子的表达。2.当NT-4与ANA-12联合给药后,磷酸化TrkB的表达较治疗组明显下降。其下游的PI3K/Akt/FoxO1及IL-6表达与GMH溶剂对照组相仿,说明在与ANA-12联合用药后,NT-4的疗效明显变差。在LY294002组中,磷酸化的TrkB水平虽然升高,但并没有增加下游PI3K的表达及Akt的磷酸化,下游蛋白FoxO1和IL-6也与GMH溶剂对照组相仿,说明在与LY294002联合用药后,NT-4的疗效明显变差。FoxO1 CRISPR组中可见,NT-4的给药能激活TrkB/PI3K/Akt通路,但无法降低FoxO1的蛋白表达,从而使下游炎症因子IL-6的水平扔居高不下。