论文部分内容阅读
背景:绝经后骨质疏松(Postmenopausal Osteoporosis,POMP)的发生和发展与雌激素缺乏后体内炎性因子的增加具有密切联系。随着女性年龄增长,维持骨量平衡的雌激素水平降低,导致炎性因子增加,破坏骨质微环境,引起骨质流失和骨质疏松。增量明显的炎性因子以肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor alpha,TNF-α)为著。前期研究结果已表明,TNF-α通过增加骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem cells,BMMCs)嘌呤能受体P2Y2受体,从而抑制其分化为成骨细胞,减少骨质形成。但是,骨质疏松的形成,一方面受成骨细胞影响,另一方面受破骨细胞影响。因此,我们假设TNF-α的增多亦能通过影响骨髓造血干细胞(Bone Marrow Hematopoietic Stem cells,BMHCs)的P2受体而影响破骨细胞的形成,且目前尚未有明确的研究结论和机制报道。因此,我们设计了相关的实验方法,探究TNF-α通过何种方式影响破骨细胞的形成。目的:1.明确TNF-α能促进BMHCs向破骨细胞分化;2.明确TNF-α能引起BMHCs特定P2受体的表达增加;3.明确特定受体的表达增加能促进BMHCs向破骨细胞分化;4.探索TNF-α促进BMHCs特定受体表达增加的信号通路。方法:1.动物实验构建经典绝经后骨质疏松模型—去卵巢(ovariectomy,OVX)小鼠:将从吉辉购买的30只8周龄雌性小鼠按照随机数表法随机分为三组,第一组行假手术并进行尾静脉注射生理盐水(SHAM组),第二组行卵巢切除术并进行尾静脉注射生理盐水(OVX组),第三组行卵巢切除术并进行尾静脉注射anti-TNF-α(OVX+anti-TNF-α组)。在相同条件下饲养12周后,进行无差别取材。取小鼠眼球血清,使用ELISA法测定其TNF-α因子水平,评估去卵巢后小鼠血清TNF-α因子水平。对标本(股骨、胫骨)固定后进行Micro-CT扫描,三维重建后评价骨超微结构的变化,并对标本进行切片和多种染色,包括苏木精——伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色、抗酒石酸酸性磷酸酶染色(Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)、免疫组化染色等方法,以评价小鼠骨小梁、破骨细胞的大体结构变化。2.细胞实验2.1收集培养骨髓造血干细胞,用不同浓度TNF-α(10、20、30ng/ml)刺激,培养不同时间(1、3、5天),进行分化干预,最后进行TRAP染色,并进行计数统计比较,探究TNF-α促进骨髓造血干细胞分化为破骨细胞的适宜浓度和时间;2.2通过对骨髓造血干细胞的不同刺激(TNF-α浓度为0、20ng/ml)培养后,检测不同时间点的P2受体,多次重复、不同方法(实施荧光定量PCR检测、Western blot),明确高表达特定受体;2.3通过转染特异性敲除质粒,抑制特定受体基因的表达,为检测质粒转染效率,分别通过TRAP染色、免疫染色及特异性基因的Western blot实验来检测小鼠骨髓造血干细胞分化为破骨细胞后各项指标的情况;2.4通过小牛骨片、仿生骨涂片的共培养,检测TNF-α因子(浓度为0、20、20ng/ml)刺激骨髓造血干细胞,分化形成的破骨细胞的骨吸收能力是否增强。结果:1.在体实验结果表明,TNF-α因子升高可促进形成绝经后骨质疏松,增加破骨细胞的产生,并可上调BMHCs P2X7受体的表达,而anti-TNF-α逆转效果显著。通过ELISA法,可以检测到造模后小鼠血清中TNF-α因子的数值,以此验证本实验所用小鼠模型及分组的合理性和可靠性。Micro-CT扫描后进行三维重建,结果分析显示,与假手术对照组(SHAM)相比,去卵巢小鼠(OVX)股骨BMD和BV/Tv降低,Tb.N升高。然而,与单纯去卵巢小鼠(OVX)相比,经anti-TNF-α治疗的OVX小鼠的骨小梁结构明显改善。HE染色(骨小梁结构)结果相似。TRAP染色结果显示,anti-TNF-α处理可明显抑制去卵巢小鼠破骨细胞的形成。免疫荧光结果显示,去卵巢小鼠标本内存在较多破骨细胞呈P2X7阳性。结果表明,去卵巢小鼠血清TNF-α因子水平明显高于其他两组,而去卵巢+抗肿瘤坏死因子-α小鼠血清中TNF-α因子水平明显低于单纯去卵巢小鼠。将三组骨髓造血干细胞取出后提取破骨细胞前体细胞中的蛋白和RNA,结果提示OVX组小鼠细胞蛋白中P2X7蛋白表达量和RNA明显增加,高于其他两组。2.体外实验结果证实,20ng/ml的TNF-α可显著诱导骨髓造血干细胞分化为破骨细胞,并显著上调P2X7的表达。在体外,用不同浓度梯度(0、10、20、30ng/ml)的TNF-α因子刺激骨髓造血干细胞,可通过分化培养获得不同数量TRAP染色阳性的破骨细胞。染色结果提示,在20 ng/ml的刺激下,骨髓造血干细胞可分化为大量破骨细胞。进一步实验表明,破骨细胞的分化与时间有关,4-5天后产生大量破骨细胞。定量逆转录聚合酶链反应结果显示,20 ng/ml TNF-α可显著上调P2X7受体。Western blot也证实了这一点。3.体外实验证实,沉默P2X7RNA,可显著抑制TNF-α因子促进BMHCs分化为破骨细胞作用,且抑制破骨细胞骨吸收作用。因此,P2X7参与了 TNF-α促进诱导破骨细胞分化的过程。为了验证P2X7受体在TNF-α因子促进BMHCs分化为破骨细胞的过程中有影响作用,我们首先采用shRNA-P2X7质粒转染目标细胞,沉默该受体的基因(过表达该受体并不增加细胞分化的数量)。Western blot分析显示,shRNA-P2X7转染后,目标细胞受体的蛋白在不同的时间点(2天和5天)均有降低。将P2X7受体沉默的骨髓造血干细胞在破骨细胞分化培养基中培养5d,而后提取不同分组的RNA和蛋白,使用RT-PCR和Western blot实验方法检测破骨细胞特异性基因的表达,包括 MMP-9、TRAP、组织蛋白酶 K(cathepsin K,CTSK)和 C-src。RT-PCR 和 Western blot结果显示,转染shRNA-P2X7的BMHCs中,标志性蛋白MMP-9、TRAP、CTSK和C-src的表达水平显著降低。此外,推测shRNA-P2X7可以抑制BMHCs分化为破骨细胞的潜能,结果如TRAP染色所示。此外,特异性免疫组化染色显示TNF-α因子可显著增加破骨细胞内P2X7受体的数量,促进破骨细胞分化。骨吸收压痕实验显示TNF-α因子能促进骨髓干细胞向破骨细胞分化,提高破骨细胞能力,而P2X7受体的抑制可显著降低TNF-α因子对骨髓间充质干细胞的作用。综上所述,这些结果提示P2X7受体参与了 TNF-α因子促进BMHSs分化为破骨细胞的过程。4.TNF-α通过PI3K/Akt信号通路上调P2X7的表达,从而促进RANKL诱导的破骨细胞分化。为了研究TNF-α因子是通过哪些信号通路上调P2X7受体表达的,我们首先观察了肿瘤坏死因子-α在骨髓造血干细胞截骨过程中对PI3K/Akt、NF-kB和丝裂原活化蛋白激酶信号通路的影响。结果提示,PI3K/Akt信号通路在TNF-α因子刺激骨髓造血干细胞向破骨细胞分化的过程中被显著激活,并且它们被TNF-α因子以时间依赖的方式激活。当PI3K被抑制剂抑制时,可显著减弱肿瘤坏死因子-α对骨髓造血干细胞分化为破骨细胞的影响。此外,当PI3K/Akt信号通路被激动剂激活时,结果显示P2X7受体相应增加。CCK-8结果显示不同试剂对破骨细胞数量的影响无统计学差异。结论:在体实验结果表明,TNF-α因子可形成绝经后骨质疏松,增加破骨细胞的产生,并可上调BMHCs P2X7受体的表达,而anti-TNF-α逆转效果显著。体外实验结果证实,20ng/ml的TNF-α可显著诱导骨髓造血干细胞分化为破骨细胞,并显著上调P2X7的表达。体外实验证实,敲除P2X7RNA,可显著抑制TNF-α促进BMHCs分化破骨细胞作用,且抑制破骨细胞骨吸收作用。TNF-α通过PI3K/Akt信号通路上调P2X7的表达,从而促进RANKL诱导的破骨细胞分化。