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第一部分 乳腺癌组织中P125的表达及启动子甲基化水平和P53表达的相关性目的:探讨P125启动子甲基化水平和在乳腺癌组织中P125及P53的表达情况方法:收集于广西医科大学附属肿瘤医院2012年10月到2013年12月期间病理确诊的乳腺癌及癌旁组织100例,（癌旁组织是指取自距肿瘤大于2cm的瘤旁组织）。焦磷酸测序检测乳腺癌及癌旁组织p125编码基因POLD1启动子的甲基化水平。采用qRT-PCR和Western blot检测POLD1及P125蛋白在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达。采用qRT-PCR和Western blot检测P53在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达。结果:焦磷酸测序显示乳腺癌组织P125编码基因POLD1启动子甲基化率为（52.51±1.86）%,明显高于癌旁组织（33.47±1.59）%,差异有统计学意义（P<0.05）。荧光定量PCR结果显示POLD1基因在乳腺癌组织的表达明显高于癌旁组织,Western blot结果显示在乳腺癌组织中P125蛋白表达水平明显高于癌旁组,其结果所示与PCR检测结果一致,差异均有统计学意义（P<0.05）。P53mRNA在乳腺癌组织及癌旁组织RT-PCR结果显示在乳腺癌组织的表达低于癌旁组织,Western blot实验结果提示P53蛋白表达情况与PCR结果是一致的,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:P125在乳腺癌组织中高表达,调控因子P53可以与POLD1启动子位点结合,可能影响POLD1启动子甲基化水平异常,与乳腺癌的发病机制相关。第二部分 慢病毒介导P53过表达对乳腺癌细胞中POLD1启动子甲基化的影响目的:构建P53基因重组慢病毒过表达载体并感染人乳腺癌细胞MCF-7,探讨其在乳腺癌细胞中对p125编码基因POLD1启动子甲基化水平的影响。方法:培养人乳腺癌细胞株MCF-7和人正常乳腺上皮细胞MCF-10A,采用qRT-PCR和Western blot检测乳腺癌细胞株MCF-7和正常乳腺上皮细胞MCF-10A中p53的表达水平。采用焦磷酸测序检测MCF-7细胞与MCF-10A细胞株POLD1启动子的甲基化水平。取对数生长期人乳腺癌细胞MCF-7接种至培养板,分别感染P53基因重组慢病毒过表达载体为转染组（rLV-P53组）;感染慢病毒空载体为阴性对照组（rLV-NC组）;空白对照组不做任何处理。焦磷酸测序检测P53过表达的MCF-7稳转细胞株POLD1启动子的甲基化水平的变化。结果:实时荧光定量PCR结果显示P53在人乳腺癌细胞MCF-7的表达低于人正常乳腺上皮细胞MCF-10A,Western blot结果显示在MCF-7中P53蛋白表达水平明显低于MCF-10A,其结果所示与PCR检测结果一致,差异均有统计学意义（P<0.05）。焦磷酸测序显示人乳腺癌MCF-7细胞株中POLD1启动子甲基化率为（57.9±8.6）%,明显高于人正常乳腺上皮细胞MCF-10A（15.6±6.2）%,差异有统计学意义（P<0.05）。构建慢病毒介导P53过表达的乳腺癌细胞MCF-7后,焦磷酸测序检测POLD1启动子甲基化率,结果显示过表达P53的MCF-7细胞为（37.6±5.6）%,显著低于人乳腺癌细胞MCF-7（57.9±8.6）%,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:P53与乳腺癌的发生有紧密的联系,在过表达P53乳腺癌细胞MCF-7中,其POLD1启动子甲基化水平明显下调,可能与P125的表达调控有关。第三部分 P53过表达对乳腺癌细胞生物学特性的影响目的:构建P53基因重组慢病毒过表达载体并感染人乳腺癌细胞MCF-7,探讨其对乳腺癌细胞生物学特性的影响及分子机制。方法:选取已构建好的感染P53基因重组慢病毒过表达载体MCF-7细胞（MCF-7/P53）和感染慢病毒空载体MCF-7细胞（MCF-7/NC）,采用CCK8细胞增殖实验观察其增殖能力。经AnnexinV-PE/7-AAD染色处理后用流式细胞仪检测其细胞周期及凋亡的变化。Transwell迁移和侵袭实验观察其迁移及侵袭能力。结果:过表达P53的MCF-7稳转细胞株及MCF-7空病毒感染细胞株经CCK8处理检测增殖情况,显示过表达P53的MCF-7细胞增殖能力明显低于对照组空病毒感染的MCF-7细胞。流式细胞仪检测各组细胞周期,对比分析显示G1期、G2期、S期数值无明显差异。流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况,显示MCF-7/P53早期凋亡率为（10.8±1.1）%,与对照组MCF-7/NC早期凋亡率（5.1±0.5）%比较,差异有统计学意义（P<0.05）,在总凋亡率 MCF-7/P53 为（11.6±1.3）%,而对照组 MCF-7/NC 为（5.3±0.6）%,两组比较差异有统计学意义（P<0.05）;但晚期凋亡率两组差异不明显。Transwell细胞迁移实验显示,过表达P53的MCF-7稳转细胞株迁移能力明显低于对照组。Transwell细胞侵袭实验结果显示,过表达P53的MCF-7稳转细胞株侵袭能力较对照组MCF-7空病毒感染细胞株明显下降,且差异有统计学意义（P<0.05）。结论:过表达P53可以抑制乳腺癌细胞增殖,降低细胞的转移和侵袭能力,可诱导乳腺癌细胞早期发生凋亡。第四部分 乳腺癌细胞中p53与Sp1、DNMT1的调控及其对p125的影响目的:探讨在乳腺癌细胞MCF-7中P53与Sp1、DNMT1调控机制及其对P125表达和启动子甲基化水平的影响方法:采用Western blot检测人乳腺癌细胞MCF-7和过表达P53的乳腺癌细胞MCF-7（MCF-7/p53）中Sp1、DNMT1的表达水平。采用免疫共沉淀法（Co-Immunoprecipitation）检测P53与Sp1的结合情况。采用双荧光素酶报告基因验证和EMSA分析方法检测SP1与DNMT1启动子的结合情况。采用Western blot法检测人乳腺癌细胞MCF-7和过表达P53的乳腺癌细胞MCF-7中P125蛋白的表达水平。结果:过表达P53的乳腺癌MCF-7稳转细胞株和乳腺癌细胞株MCF-7,Westernblot检测结果显示Sp1及DNMT1蛋白在MCF-7和MCF-7/P53中均表达,且与空白MCF-7对比过表达P53的MCF-7细胞株,Sp1及DNMT1的蛋白表达量均显著下调。免疫共沉淀实验结果显示在乳腺癌细胞中P53蛋白能与Sp1蛋白相结合。双荧光素酶报告基因方法显示,突变DNMT1基因启动子荧光素酶报告基因活性比较正常启动子的荧光素酶报告基因活性明显受到抑制（P<0.05）,后经EMSA实验结果分析说明在乳腺癌细胞中Sp1可以结合到DNMT1的启动子上。Westernblot法检测P125表达水平,结果显示与MCF-7对比过表达P53的MCF-7稳转株,P125蛋白表达量明显下降,说明P125表达水平受到P53的调控。结论:在乳腺癌细胞中P53蛋白能够与Sp1蛋白结合,并调控Sp1的表达,Sp1可以作为转录因子与DNMT1启动子发生特异性结合,影响P125启动子甲基化水平,进而调控P125的表达。