研究背景2020年,全球女性乳腺癌新发病例数己超过肺癌,成为全球癌症发病率第一的癌症,估计有226.14万新发病例,死亡率为6.9%。在我国国内,乳腺癌同样是女性诊断数量最多的恶性肿瘤,我国女性新发乳腺癌病例数约41.64万,乳腺癌新发病例数仅次于肺癌、结直肠癌和胃癌。炎症性骨破坏疾病是一类由微生物产物或炎症性因子引起的骨质丢失的疾病,比如类风湿性关节炎、牙周炎等。全球约有2亿人深受骨质过量流失导致的疾病困扰。因此,研究治疗乳腺癌和骨破坏的药物具有临床应用价值。研究目的Tablysin-15是从牛虻的唾液腺中发现的一种含RGD的去整合素,能以高亲和力结合整合素αvβ3。本文旨在运用分子生物学和药理学研究方法探讨Tablysin-15对整合素αvβ3高表达的转移性乳腺癌细胞株MDA-MB-435s、MDA-MB-231和破骨细胞的体内外作用及其潜在机制,以便为将Tablysin-15应用于乳腺癌和骨破坏疾病提供理论基础。研究方法1.以MDA-MB-435s、MDA-MB-231和MCF-7为模型,通过细胞粘附实验、抗体竞争性结合实验、分子对接实验验证Tablysin-15是否与整合素αvβ3发生结合;通过MTT、CTL发光法检测Tablysin-15对它们影响;通过DAPI染色、DNA Ladder、Western Blot实验和PI染色检测Tablysin-15对细胞凋亡和细胞周期的影响;通过Western Blot检测Tablysin-15对周期相关信号通路的影响;通过划痕实验、Transwell实验、qRT-PCR、明胶酶谱实验检测Tablysin-15对细胞迁移的影响;通过体内肿瘤移植瘤小鼠模型检测Tablysin-15的体内抗乳腺癌活性。2.以RANKL诱导形成破骨细胞为模型,通过TRAP染色、F-actin染色、骨吸收陷窝实验检测Tablysin-15对破骨细胞生成和骨吸收能力的影响;通过Western Blot、qRT-PCR、抗体竞争性结合实验检测Tablysin-15对破骨细胞生成相关信号通路的影响;构建LPS诱导小鼠骨破坏模型检测Tablysin-15对骨破坏模型的保护作用。实验结果1.Tablysin-15能通过结合到整合素αvβ3抑制整合素αvβ3高表达的MDA-MB-43 5s和MDA-MB-231乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。其机制归因于Tablysin-15使细胞阻滞在G0/Gi期细胞周期,而非细胞凋亡或坏死。Tablysin-15还在显著抑制MMP-2/9、VEGF和COX-2 mRNA表达的同时上调TIMP-1/2的mRNA表达。此外,在增加CDK抑制剂p21wafl/C1表达的同时,Tablysin-15抑制了转移性乳腺癌细胞的CDK2、CDK6、Cyclin D1、Cyclin E蛋白的表达,和FAK及其下游通路的Akt、GSK-3β、ERK的磷酸化,以及NF-κB p65的核转位。最后,Tablysin-15在体内具有显著的抗乳腺癌作用。2.Tablysin-15浓度依赖地抑制了 RANKL诱导的破骨细胞生成、F-actin环的形成和破骨细胞的骨吸收。Tablysin-15还通过结合整合素αvβ3抑制RANKL诱导的FAK相关信号通路以及MAPK、NF-κB和Akt-NFATc1通路的激活。此外,Tablysin-15在抑制了负责细胞骨架重组和细胞融合的Cofilin和DC-STAMP的表达的同时降低了 MMP-9、TRAP、CTSK和c-Src等与破骨细胞形成有关基因的表达,然而Tablysin-15增加了 Cofilin的磷酸化。最后,在小鼠骨破坏模型中,Tablysin-15显著抑制了 LPS诱导的骨质丢失。本文结论Tablysin-15在体外能抑制转移性乳腺癌的增殖、迁移。在体内,Tablysin-15能抑制肿瘤瘤体的生长;Tablysin-15在体外能抑制破骨细胞的形成和骨吸收能力。在体内,Tablysin-15能缓解急性炎症性骨破坏。因而,Tablysin-15将是治疗乳腺癌和骨破坏疾病的优良候选药物分子。