青稞(Hordeum vulgare L.var.nudum,2n=14)为禾本科大麦属作物,因籽粒与颖壳分离,又称为裸大麦。青稞是我国藏族同胞的主要口粮,在海拔4200米以上的高寒地带,是唯一能正常成熟的谷物。大量研究表明,青稞具有“三高两低”(高蛋白、高纤维、高维生素和低脂肪、低糖)的特点,是一种营养保健型谷物。与白粒青稞相比,因黑粒青稞富含花青素、酚类化合物、人体必需氨基酸和微量元素等营养保健成分,越来越受到人们的关注。本研究通过简化基因组测序技术(SLAF-seq)构建了青稞高密度遗传连锁图谱,对青稞的黑粒基因进行了初步定位,根据与大麦参考基因组的比对的注释和转录组测序结果对黑粒候选基因进行了预测、克隆及功能预测。此外,研究了候选基因Hvt GT与Hvt HID在不同粒色青稞籽粒成熟后期及在黑色籽粒形成早、中、晚的表达模式。初步揭示了Hvt GT与Hvt HID在粒色形成过程中的色素沉积的竞争关系,为青稞籽粒颜色的形成及调控机理的研究提供初步线索。具体研究结果如下:1.青稞黑粒基因的定位与候选基因挖掘:以黑粒青稞“昆仑17”为母本,白粒青稞“白91-97-3”为父本构建F2群体并进行表型统计。结果表明,正交和反交的黑粒、黑白中间型、白粒青稞的比值均约为1:2:1,推测青稞黑粒性状主要是由单个不完全显性基因调控的。通过SLAF-seq对F2群体进行测序,初步定位控制青稞黑粒基因,将目标性状定位于1号染色体上的547.69Mb-548.79Mb、548.80Mb-548.90Mb和554.56Mb-555.85Mb三个区段。与参考基因组比对发现,三个候选区段共包含58个候选基因。根据Swissprot、NR、COG、GO、KEGG等数据库注释结果,结合青稞黑粒形成不同时期的转录组测序结果和已知的花青素通路,确定GT1(基因ID:HORVU1Hr1G092650)为控制青稞黑粒形成的候选基因,该基因位于1号染色体554.56Mb-555.85Mb,命名为Hvt GT。2.通过RT-PCR技术,从黑粒青稞“昆仑17”和白粒青稞“白91-97-3”籽粒中克隆了Hvt GT基因。序列分析结果表明,两者的CDS均为1470bp,编码489个氨基酸,但黑粒Hvt GT与白粒Hvtgt的基因序列有5个A与G之间的互相颠换,导致黑粒Hvt GT与白粒Hvtgt有5处氨基酸差异。生物信息学分析表明,Hvt GT编码GT-B型UDP糖基转移酶,Hvt GT为结构基因。进化树分析表明,青稞Hvt GT糖基转移酶与大麦的亲缘关系最近,与籼稻和短花稻的亲缘关系最远。利用Gateway技术将获得表达载体PYPQ203–Hvt GT。通过农杆菌介导的转化烟草获得转Hvt GT基因的烟草阳性苗25株,但在转基因烟草中均没有发现花青素的沉积。3.通过RT-PCR技术,从黑粒青稞“昆仑17号”籽粒中克隆Hvt HID基因,CDS为1080bp,编码327个氨基酸。Hvt HID基因的蛋白由无规卷曲、α-螺旋、延伸链、β-转角组成,且无规卷曲为主,β-转角最少。进化树分析表明,青稞2-羟基异黄酮脱水酶与大麦的亲缘关系最近,与粟和狗尾草的亲缘关系较远。生物信息学分析结果显示Hvt HID编码Abhydrolase＿3(α/β水解酶)超家族羧酸酯酶,Hvt HID为结构基因。利用Gateway技术将获得表达载体PYPQ203–Hvt HID。通过农杆菌介导的转化烟草获得转Hvt HID基因的烟草阳性苗9株,在转基因烟草中也没有发现花青素的沉积。4.在不同粒色品种青稞成熟后期,Hvt GT在“黑老鸦”(黑粒)的表达更为丰富,Hvt HID在“涅如姆扎”(紫粒)的表达更为丰富。Hvt GT基因表达量由高低顺序为“昆仑17号”(黑粒)>“涅如姆扎”(紫粒)>“达章紫”(紫粒)>“黑老鸦”(黑粒)>“昆仑12”(白粒)>“INB0N-7”(蓝粒)。Hvt HID基因表达量由高低顺序为“涅如姆扎”(紫粒)>“昆仑17”(黑粒)>“黑老鸦”(黑粒)>“昆仑12”(白粒)>“达章紫”(紫粒)>“INB0N-7”(蓝粒)。推测Hvt GT和Hvt HID基因参与了青稞籽粒的着色过程。在黑粒青稞“昆仑17”籽粒形成过程中,Hvt GT的表达量逐渐升高,在播种后14周的表达量达到最高峰值。Hvt HID的表达量逐渐降低,在播种后14周的表达量达到最低。Hvt GT和Hvt HID在黑粒青稞“昆仑17”籽粒形成过程中的表达模式相反,推测在青稞黑粒形成过程中Hvt GT和Hvt HID基因可能在合成通路中存在着一定的竞争关系。