肠道病毒71(EV71)与宿主限制因子相互作用分子机制的研究

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肠道病毒71(EV71)作为引起手足口病的主要病原体,一直被大家广泛关注,由其引起的手足口病每年都会在全球各地爆发。更令人担忧的是EV71会诱导重症手足口病,其症状为肺水肿,无菌性脑膜炎等,甚至少数病儿病情发展迅速,出现致死病例。尽管手足口病每年都会爆发,但针对EV71的治疗性药物却一直处于空缺的状态。所以,为了研发针对EV71乃至肠道病毒通用的特异性药物,肠道病毒的感染机制及其与宿主限制因子相互作用的研究迫在眉睫,而且是必经之路。基于前人的研究,本研究主要研究了EV71与宿主限制因子的相互作用。根据宿主因子的不同,主要分为两部分:第一部分:EV71与宿主限制因子A3G的相互作用及机制研究。首先,我们在A3G高表达的H9细胞和几乎不表达A3G的Jurkat细胞中进行了相同滴度的EV71病毒感染,发现了A3G对EV71的抗病毒作用。随后,我们在A3G敲低的H9细胞系和过表达A3G的HEK293T细胞中进行了EV71病毒感染实验,再次验证了A3G对EV71的抗病毒作用。其次,在A3G存在的情况下,我们考察了病毒的RNA和蛋白水平变化。结果发现,A3G影响了EV71的RNA复制,进而影响了病毒蛋白的表达。最后,我们对A3G抗EV71病毒的机制进行了研究,结果发现A3G的抗EV71活性并不依赖其著名的胞嘧啶脱氨酶活性,这说明,A3G还有其他方式发挥抗肠道病毒的作用。这也是首次鉴定了A3G对肠道病毒的限制作用,并指出其潜在的全新的抗病毒机制。通过免疫共沉淀、EMSA等技术手段,我们发现A3G能够结合EV71病毒RNA,并确定了A3G结合5’UTR的关键位点。那么,A3G的结合是改变了病毒RNA的二级结构,还是影响了EV71复制所需的其他转录调控因子呢?为了探索其作用机制,在A3G存在的情况下,我们考察了EV71复制及翻译必须的一些转录因子与EV71-5’UTR的结合情况。我们发现,在A3G存在时,PCBP1与EV71-5’UTR的结合减弱。随后,我们通过RNA pull down实验和RNA IP实验证明了A3G竞争PCBP1的情况,详细阐明了A3G限制EV71病毒复制的分子机制。在病毒与宿主的相互作用中,病毒也进化出了逃避宿主的相应机制。那么,EV71病毒是如何逃避宿主限制因子A3G的作用呢?在研究A3G抗EV71的机制过程中,我们发现EV71病毒的非结构蛋白2C能够特异性的下调A3G蛋白的表达。为了探索2C蛋白下调A3G的机制,我们首先利用RT-PCR技术,确定了2C并不能下调A3G的m RNA。其次,通过加入MG132和Baf-A1等抑制剂,确定了2C通过自噬-溶酶体途径降解A3G。同时,通过免疫共沉淀和免疫荧光技术,我们发现2C可以特异性的结合A3G,并令其泛素化,进而诱导A3G进行选择性的自噬降解。总之,我们发现了A3G对EV71的限制作用,并系统的阐述了A3G限制EV71的分子机制。同时,我们还发现EV71病毒突破A3G限制作用的机制,即利用非结构蛋白2C诱导A3G进行选择性自噬。第二部分:EV71与宿主限制因子SAMHD1的相互作用及其机制研究。首先,我们通过EV71感染不同细胞的敏感性不同,进行了限制性因子的筛选,发现了SAMHD1对EV71病毒复制的限制作用。又通过RNA干扰技术,构建SAMHD1敲低的稳定细胞系,确定了SAMHD1的抗病毒作用。其次,我们比较了野生型SAMHD1及其各种活性缺失突变体的抗病毒的活性。结果发现,SAMHD1抗EV71病毒的作用与已报道的活性,如d NTPase活性,RNAse活性,及SAMHD1的四聚化均无关。但与SAMHD1在592位的磷酸化与否有关,且与SAMHD1限制HIV复制的作用一致,即非磷酸化的SAMHD1有抗病毒作用,而磷酸化的SAMHD1失去了抗病毒活性。在我们利用EV71易感细胞系—RD细胞构建稳定表达SAMHD1细胞系时发现,即使进行了过量表达,SAMHD1蛋白表达量依然很低,而加入MG132可以增加SAMHD1的表达量。这表明在RD细胞中存在特异性降解SAMHD1的途径。通过免疫共沉淀串联质谱的检测方法,我们筛选出了对SAMHD1进行泛素化的E3泛素连接酶—TRIM21。同时,通过点突变的方式,鉴定出SAMHD1被泛素化的位点是第622位的赖氨酸。在EV71感染的细胞中,我们发现TRIM21的表达大大提高,而SAMHD1被降解。为了验证三者的关系,我们构建了SAMHD1-K622A突变体(不能被TRIM21泛素化),结果发现,SAMHD1-K622A突变体不能被EV71降解。同时,根据文献报道,TRIM21作为一类干扰素刺激基因(ISG),能够被干扰素激活表达。我们通过建立IFNAR1敲低的稳定细胞系,确定了在IFNAR1被敲低后,EV71下调SAMHD1的能力大大减弱。以上结果,共同的证明了EV71突破SAMHD1的限制作用是通过病毒复制过程中激活的干扰素系统,诱导了TRIM21的表达,进而达到降解SAMHD1的目的。综上,本论文综合的研究了肠道病毒EV71与宿主限制因子(A3G和SAMHD1)之间的相互作用分子机制。为研发针对EV71感染的特异性新药提供了潜在靶点,也为病毒与宿主相互作用方式的研究提供了新方向。
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