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目的:子宫内膜异位症（endometriosis,EMs,简称内异症）是妇科常见病及难治病。内异症虽为良性疾病,却可表现出局部种植、侵袭及远处转移等类似恶性行为,常引起进行性痛经、慢性盆腔痛及不孕等症状,严重影响患者的身心健康。近年来,随着对内异症发病机制研究的深入,人们已认识到内异症一种雌激素依赖的多因素疾病:内异症在位内膜细胞功能改变,如细胞增殖、迁移及侵袭增强,及经血逆流可能是形成异位种植的基本条件,而免疫功能异常及异位病灶雌激素代谢改变等同样在内异症发生中起重要作用。BCAR3（Breast cancer anti-estrogen resistance 3）基因,又称AND-34或NSP2,属NSP（novel Src homology2（SH2）-containing protein）家族。有报道显示BCAR3异常高表达可增强细胞粘附、迁移及侵袭,并促进细胞生发上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transitions,EMT）。此外,BCAR3蛋白能在活体外诱导雌激素依赖性乳腺癌细胞对抗雌激素药物产生耐药,是导致雌激素受体阳性乳腺癌患者抗雌激素药物耐药而使内分泌治疗失败的重要原因之一。抗雌激素作用是避免内异症发生的保护因素,而局部抗雌激素作用被抑制将促进异位病灶形成。那么,BCAR3是否为促进内异症发生、发展的候选基因之一值得探讨。生物信息学预测软件结果显示BCAR3基因是miR-126-5p下游靶标之一。miR-126-5p及miR-126-3p来自同一前体pre-miR-126,在多种组织及细胞中表达水平相当,变化趋势相同,发挥相似的功能。在癌细胞中,miR-126-5p、miR-126-3p表达的降低可增强癌细胞增殖、侵袭能力。本课题组前期研究显示:miR-126-3p在内异症在位内膜间质细胞中低表达,其表达水平下降导致间质细胞增殖、侵袭性显著增强。那么miR-126-5p是否在内异症中表达异常及是否可通过靶向调节BCAR3基因调控内膜细胞功能有待验证。本研究旨在围绕BCAR3基因对内异症在位内膜细胞功能的影响及可能的调控机制进行研究,为内异症发病机制提供新的理论依据。研究方法:本研究选取32例内异症患者的异位内膜和在位内膜及31例对照组子宫内膜作为研究对象,收集临床资料,通过实时荧光定量PCR（Quantitative real-time polymerase chain reaction、qRT-PCR）、免疫组化及蛋白免疫印迹方法（Western blot）方法检测BCAR3蛋白及m RNA的表达情况,通过qRT-PCR检测上述样本中miR-126-5p的表达情况,进行相关性分析。通过免疫组化技术检测异位内膜、在位内膜及正常内膜中间质细胞相关蛋白波形蛋白（vimentin）及上皮细胞相关蛋白E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达情况。体外培养原代在位内膜上皮细胞,通过慢病毒构建BCAR3过表达模型,利用Western Blot检测细胞感染后BCAR3蛋白表达情况,通过观察细胞形态及Western Blot检测E-cadherin、vimentin及纤连蛋白（fibronetin）蛋白表达情况,评估BCAR3对内异症上皮间质转化的影响。雌激素单独或联合雌激素拮抗剂处理在位内膜上皮细胞或过表达BCAR3的上皮细胞,观察细胞形态及Western Blot检测E-cadherin、vimentin及fibronetin蛋白表达情况。联合雌激素与BCAR3高表达慢病毒处理在位内膜上皮细胞后再次观察细胞形态,检测E-cadherin、vimentin及fibronetin蛋白表达情况。利用体外在位间质细胞原代培养,采用Western blot及qRT-PCR对内膜间质细胞中BCAR3及miR-126-5p表达量进行检测并分析相关性。内异症在位内膜间质细胞中转染miR-126-5p agomir,正常内膜间质细胞antagomir,qRT-PCR验证转染效率后,利用CCK8及Transwell检测细胞增殖及迁移、侵袭能力,Western Blot检测BCAR3蛋白水平。通过慢病毒构建BCAR3过表达及敲低模型,western blot检测慢病毒感染后BCAR3蛋白水平后,利用CCK8及Transwell检测细胞增殖及迁移、侵袭能力。培养293T细胞,将含有野生型BCAR3 3’UTR（WT-BCAR3）或突变型BCAR3 3’UTR（Mut-BCAR3）的pMIR-report报告基因质粒与miR-126-5p agomir共转染293T细胞,利用Dual-Glo?Luciferase Assay System检测荧光素酶活性。Pre-miR-126-5p重组慢病毒感染在位内膜间质细胞,qRT-PCR检测miR-126-5p过表达后,再次感染BCAR3重组慢病毒或阴性对照病毒。miR-126-5p干扰慢病毒感染正常内膜间质细胞,待miR-126-5p沉默后再次感染BCAR3干扰慢病毒或阴性对照病毒,Western Blot检测BCAR3在各组细胞表达水平,利用CCK8及Transwell检测各组细胞的增殖及迁移、侵袭情况。结果:1、qRT-PCR及Western blot结果显示:BCAR3 mRNA及蛋白表达水平,异位内膜显著高于在位内膜（P<0.01、P<0.01）,在位内膜又显著高于正常对照（P<0.05、P<0.01）。miR-126-5p qRT-PCR结果显示:异位内膜表达量最低,在位内膜组次之,正常子宫内膜组最高,三组间存在显著差异,P<0.01。Pearson’s相关性分析提示:miR-126-5p与BCAR3 mRNA呈弱负相关r=-0.417,P<0.01;miR-126-5p与BCAR3蛋白呈强负相关:r=-0.669,P<0.01。免疫组化结果提示,BCAR3蛋白同时表达于内膜上皮及间质细胞中,上皮细胞中:异位内膜其表达量明显高于在位内膜（P<0.05）,在位内膜和正常子宫内膜比较无显著差别;而在间质细胞中,异位内膜表达量最高,在位内膜组次之,正常子宫内膜组最低,三者间差别有统计学意义（P<0.01）。vimentin蛋白表达于内膜上皮细胞及间质细胞中,其中在异位内膜上皮细胞表达量高于在位内膜上皮细胞（P<0.05）,后者与正常内膜上皮细胞无显著差别;E-cadherin蛋白仅表达于上皮细胞,在异位内膜表达量明显低于在位内膜（P<0.05）,在位内膜和正常内膜无显著差别。2、体外培养原代在位内膜上皮细胞,在位内膜上皮细胞感染BCAR3重组慢病毒组,与阴性对照组和空白对照组相比,BCAR3蛋白表达水平明显上调（P<0.05）,fibronectin表达显著增加,细胞形态发生间质改变,表现为细胞生长分散,细胞成长梭形,（P<0.05）,但E-cadherin和vimentin表达差别没有统计学意义（P>0.05）。雌激素处理在位内膜上皮细胞组（E2组）,出现类似间质细胞表型,相比对照组,E-cadherin表达水平下调（P<0.05）,vimentin及Fibronectin表达上调（P<0.01）。而雌激素拮抗剂可以抑制雌激素的这一作用。BCAR3及对照慢病毒感染24小时后,用雌激素处理各组细胞。与单独雌激素干预组比较,感染BCAR3重组慢病毒联合雌激素组fibronectin表达明显上调,细胞形态改变发生提前（P<0.05）,但E-cadherin及vimentin表达无明显差异（P>0.05）。3、体外培养原代在位内膜间质细胞,qRT-PCR提示:在位内膜间质细胞组miR-126-5p表达水平较正常内膜间质细胞组显著降低（P<0.01）。qRT-PCR及Western blot结果显示,在位内膜间质细胞组BCAR3 mRNA及蛋白表达水平较正常内膜间质细胞组上调（P<0.01、P<0.01）。Pearson’s相关性分析,发现miR-126-5p表达水平与BCAR3 m RNA（r=-0.318,P<0.05）及蛋白表达水平均存在负相关（r=-0.756,P<0.01）。qRT-PCR及Western blot结果提示:与对应的对照组相比,转染miR-126-5p agomir组,miR-126-5p表达上调（P<0.01）,BCAR3蛋白表达下调（P<0.01）,而转染miR-126-5p antagomir组,miR-126-5p表达降低（P<0.01）,BCAR3蛋白表达升高（P<0.05）;CCK8及Transwell结果显示,与对应的对照组相比,转染miR-126-5p agomir组在位内膜间质细胞增殖、迁移及侵袭能力明显降低（P<0.05、P<0.01、P<0.01）,而转染miR-126-5p antagomir组正常内膜间质细胞增殖、迁移及侵袭能力明显增强（P<0.05、P<0.01、P<0.01）。Western blot结果显示,与对应的对照组相比,感染BCAR3重组慢病毒组正常内膜间质细胞,BCAR3表达上调（P<0.01）,而感染BCAR3敲低慢病毒组在位内膜间质细胞,BCAR3表达下调（P<0.01）。CCK8及Transwell结果显示,与对应的对照组相比,过表达BCAR3后细胞增殖、迁移及侵袭能力明显增强（P<0.05、P<0.01、P<0.01）,而沉默BCAR3后细胞增殖、迁移及侵袭能力明显降低（P<0.05、P<0.01、P<0.01）。双荧光素酶基因报告系统显示:WT-BCAR3与miR-126-5p共转染后荧光素酶活性明显下降（P<0.01）,而Mut-BCAR3与miR-126-5p共转染后荧光素酶活性无明显变化。CCK8及Transwell结果显示,与miR-126-5p过表达组相比,miR-126-5p联合BCAR3过表达组内膜间质细胞增殖、迁移及侵袭能力显著提高（P<0.05）;与miR-126-5p沉默组相比,miR-126-5p联合BCAR3沉默组内膜间质细胞增殖、迁移及侵袭能力显著降低（P<0.05）。结论:1、子宫内膜异位症异位及在位内膜组织中BCAR3表达增高,而miR-126-5p表达下降,两者呈负相关。异位内膜上皮细胞中vimentin蛋白高表达,而E-cadherin低表达,提示EMT参与内异症发生、发展。2、内异症在位内膜上皮细胞可在雌激素诱导下发生EMT。而过表达BCAR3并不能引起EMT,但BCAR3可协同雌激素增加fibronectin分泌,促进上皮细胞形态向间质细胞改变。3、内异症在位内膜间质细胞中BCAR3高表达可促进细胞增殖、迁移及侵袭,BCAR3基因表达及功能受到miR-126-5p直接调控,miR-126-5p-BCAR3轴表达异常,导致细胞功能紊乱,可能是内异症发生的分子机制之一。