爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)rDNA-ITS的分子鉴定及异时性基因在早期发育中的定位

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根结线虫是重要的植物内寄生线虫。本论文以同安农田日采集的番茄病根中爪哇根结线虫为实验材料,对病根进行解剖,收集成虫、二期幼虫和卵块。通过对根结线虫胚胎发育和生活史中各期虫体形态的观察,进一步定种为爪哇根结线虫。通过感染室内土培番茄,使得爪哇根结线虫在实验室得到进一步的扩大培养,为后续实验的进行提供了材料。 利用rRNA基因间隔序列的保守性引物对来自不同宿主的爪哇根结线虫和南方根结线虫的rDNA-ITS1和rDNA-ITS2序列进行了扩增,与Genebank中根结线虫的ITSl序列在clustalX软件中进行了分析,构建系统发生树和遗传距离矩阵。分析可知,来源于番茄根内和蒲公英根内的爪哇根结线虫rDNA-ITSl序列,仅存在1个碱基的差异,与南方根结线虫问存在187个碱基的差异。爪哇根结线虫种内不同个体间的遗传距离小于与南方根结线虫的种间遗传距离,表明来自不同宿主的爪哇根结线虫的亲缘关系很近,而与南方根结线虫亲缘关系较远。因此ITS序列可作为鉴定根结线虫亲缘关系远近的有效工具。 利用合成的C.elegans异时性基因let-7、lin-28、lin-4和lin-14的探针,通过整体原位杂交的方法,在爪哇根结线虫胚胎发育的不同阶段及早期幼虫体内检测异时性基因的分布。在胚胎、L1和L2期幼虫体内都检测到let-7mRNA的存在,在胚胎发育中主要分布于胚胎的两端和靠近卵壳的细胞中,在幼虫期分布于虫体的头部、食道球、消化道和尾部;lin-28mRNA在胚胎中的分布与let-7mRNA的分布相同,在幼虫中主要分布于头部、消化道和尾部;在L2期的分布范围比L1期有所减小,推测可能lin-28mRNA在L2期的下调与C.elegans中lin-28在L2期的表达受到lin-4和lin-14的双重调控作用相同:lin-4主要在L1期和L2期幼虫体内检测到了mRNA的分布,且在体壁和消化道内染色较深;lin-14tuRNA在胚胎内分布于胚胎外胚层细胞中,幼虫中也多位于体壁细胞、食道球和消化道内。 以爪哇根结线虫基因组DNA和cDNA为模板,扩增C.elegans的lin-28同源性片段,将扩增片段构建到pMD18-T载体上,酶切鉴定后测序,所得序列与C.elegans中lin-28的序列在Genedoc软件中进行比对和分析,同源性达到83%。为进一步研究爪哇根结线虫中lin-28同源性基因的功能提供了基础。
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