论文部分内容阅读
低聚果糖是一种功能性低聚糖，由于其能够调节人体肠道内的菌群平衡，润肠通便，还具有降血脂、降胆固醇，促进矿物质的吸收以及维生素的合成等功能，已在现代人们的生活中得到广泛的重视和应用。现代工业上主要是以蔗糖为底物，以能产生果糖基转移酶的米曲霉为菌株来生产低聚果糖，因此选育果糖基转移酶活力较高的米曲霉菌株对于工业生产低聚果糖具有重大的实际意义。本文以米曲霉SBB201为出发菌株，酶解制备原生质体并再生，通过紫外-氯化锂复合诱变构建突变文库，再以此为原生质体融合的出发菌株，基于非对称灭活标记以及致死损伤互补理论，利用基因组重排技术选育目标菌株，并应用分子生物学的技术初步鉴定了融合菌株酶活的提高与基因表达量之间的关系。本文主要的研究内容及结果如下：1、对原生质体的制备及再生条件进行了研究。发现，菌丝在30℃，150r/min的条件下培养20h后，通过溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶的共同作用，31℃酶解2.5h时，制得的原生质体的数量和再生率都比较适宜。2、对亲本米曲霉的分生孢子进行紫外-氯化锂复合诱变构建突变文库，并对原生质体的双灭活以及融合条件进行了实验研究。通过诱变得到两株酶活较原始菌株有提高的米曲霉UV-A以及UV-B并以此两菌株作为基因组重排的亲本菌株。通过原生质体灭活曲线确定紫外灭活的参数是在15W紫外灯下30cm处照射5min，热灭活的参数是65℃水浴处理5min。对原生质体融合的影响因素进行研究发现，以50%的PEG（6000）在pH7.5的条件下融合5min融合率较高，融合子的性能也较好。3、通过多轮基因组改组筛选融合子并对融合子的果糖基转移酶的酶活进行测定，最终得到一株果糖基转移酶的酶活力达到178.90U/g的菌株RⅢ-7，较原始菌株的酶活力105.09U/g提高了70.24%。并对融合菌株的遗传稳定性进行研究，证明融合菌的遗传稳定性良好。4、应用实时荧光定量PCR技术对原始菌株和融合菌株果糖基转移酶基因的表达进行了比较，发现酶活提高的菌株其对应基因的表达量也相对较高，而酶活降低的融合菌其基因的表达量也相对较低，说明酶活的高低与基因的表达量之间存在一定的相互关系。