肾细胞癌占全身恶性肿瘤的2%-3%左右,全球每年新发肾细胞癌150,000例,60,000例患者因该肿瘤过世。肾上皮性肿瘤约占肾脏肿瘤85%。在我国泌尿男性生殖系统恶性肿瘤中居第二位,仅次于膀胱癌,近年来随着环境大气水污染的加重,肾细胞癌的发生率也有日渐增加的趋势。透明细胞癌嗜酸变型,乳头状癌,嫌色细胞癌嗜酸变型,嗜酸细胞腺瘤为几种相对常见肾上皮嗜酸细胞肿瘤,这几种良恶性程度不同的肿瘤,在临床工作中常使得病理医生困惑。准确的病理分型决定了不同的预后判断和相应的治疗措施制定。肾脏肿瘤不同的组织学分型代表不同的治疗及预后状况。免疫组化检测与胶体铁染色可用于鉴别诊断,但免疫组化常存在假阳性和假阴性结果,由于几种肿瘤相对发病率较低,也较少有相关的大宗病例研究报道。而胶体铁染色阳性不仅仅限于嫌色细胞癌,确切解读染色结果困难。WHO(2004)在对肾脏肿瘤的组织学分类中已将不同肿瘤与特定的遗传学差异改变相联系,这标志病理学界对肾脏肿瘤的认识已从形态学深入到分子遗传学水平。提示进一步的分子检测将有助于找到肾肿瘤特定基因变化及其对于肾肿瘤的发生发展及预后判断的影响。MicroRNA是一类大约长为18-25个核苷酸(nt)非编码单链小分子RNA。当前已被发现的人类MicroRNA超过1000种。目前认为人体中可能有超过三分之一的基因是被microRNA所调节的。microRNA的表达具有高度的物种保守性、时序性和组织特异性,其中细胞特异性或组织特异性是microRNA表达的主要特点。microRNA可能成为新的肿瘤标记物和细胞、组织特征性鉴定分子,microRNA的检测可能成为疾病诊断及预后判断的很有前途和应用价值的新指标。目前已有数10项基于microRNA芯片技术在肾脏肿瘤中的研究已经发表,其中包括肾肿瘤与配对正常组织比较研究,也有不同肿瘤亚型间比较研究。从这些分别独立的研究中可以看出：1,目前较多研究在透明细胞癌和正常组织间的比较；2, miR-210、hsa-miR-155在肾透明细胞癌中显著上调；3, hsa-miR-141、 hsa-miR-200C在肾透明细胞癌中显著下调；4, hsa-miR-126在透明细胞癌中表达高于乳头状癌；5,肿瘤鉴别诊断研究较少,尤其嗜酸细胞腺瘤和嫌色细胞癌的比较研究数量很少；6,已发表研究均采用芯片技术完成。以上结果提示这些多项研究产生的共同结果microRNA分子可能应用于临床检测,并不再需要使用昂贵的芯片技术,只需用逆转录real time-PCR (RT-PCR)技术验证即可。因此本研究收集147例肾上皮嗜酸细胞肿瘤,其中包括嗜酸细胞腺瘤47例,嫌色细胞癌嗜酸亚型44例,透明细胞癌嗜酸变型20例,乳头状癌36例,了解其临床特点,镜下形态特征,分析免疫组织化学表达状况,并挑选出包括6个候选microRNA肿瘤标记物对147例肾嗜酸细胞肿瘤进行qRT-PCR检测,对比四种亚型肾上皮嗜酸细胞肿瘤的差异,在训练组中(Training set)通过C-statistics方法,ROC曲线,计算曲线下面积(AUC),确立界点值(cut-off point),并在验证组(validation set)中验证已建立的模型并评估其在鉴别不同病理亚型中的诊断价值。第一部分：肾上皮嗜酸细胞肿瘤的临床病理特征目的：通过对147例肾嗜酸细胞肿瘤的临床特点分析和病理形态观察,其中6例电子显微镜观察,总结肾嗜酸细胞肿瘤的临床病理学特征方法：经两位经验丰富的病理医生复习中山医院病理科2000年～2010年12月11年间常规外检连续肾细胞癌标本2000余例,挑选出其中嗜酸细胞腺瘤47例,嫌色细胞癌嗜酸亚型44例,透明细胞癌嗜酸变型20例；乳头状癌36例从2009年和2010年存档切片中挑取。此147例标本再请在泌尿系统病理诊断有丰富经验的3位病理医生独立进行HE切片诊断。嗜酸细胞腺瘤4例、嫌色细胞癌1例及透明细胞癌嗜酸变型1例取福尔马林固定组织,2.5%戊二醛固定,透射电镜(JEOL12001X)检测。对患者进行电话随访。结果：三位病理医生与原诊断一致典型四种嗜酸细胞肿瘤73例,其中透明细胞癌嗜酸变型14例,嫌色细胞癌嗜酸变型15例,嗜酸细胞腺瘤14例,乳头状癌30例。四种肿瘤均有其典型病理形态,但在不典型透明细胞癌中见假乳头样结构,易与乳头状癌混淆；乳头状癌中见实性片状生长背景,又容易与透明细胞癌混淆；嫌色细胞癌嗜酸变亚型细胞没有典型的厚壁胞膜,细胞核皱缩、不规则、核周空晕特征也不显著,容易与肾透明细胞癌嗜酸变型、嗜酸细胞腺瘤混淆；嗜酸细胞腺瘤内可以有丰富的血管、可见乳头结构、腺体、少量细胞透亮、细胞异型甚至细胞内出现核仁,需要与其他三型肿瘤鉴别。电镜观察：嗜酸细胞腺瘤中均可观察到丰富的板层状嵴线粒体,细胞核圆形规则；嫌色细胞癌中线粒体也丰富,但线粒体为管泡状嵴；1例透明细胞癌嗜酸变型中线粒体数量稀少。临床随访中,因肿瘤直接致死病例均为透明细胞癌嗜酸变型和乳头状癌。结论：典型肾嗜酸细胞肿瘤具有2004版WHO分类所描述的病理形态,但有一些病例具有不典型病理形态,容易导致误诊。区分透明细胞癌嗜酸变型与乳头状癌,病理形态观察的关键是要把握真假乳头的结构；正确诊断嫌色细胞癌嗜酸变型需仔细观察细胞核和细胞膜细微变化；嗜酸细胞腺瘤出现不典型的病理形态需非常慎重鉴别诊断。肾嗜酸细胞肿瘤诊断具有很大的迷惑性,仅仅依靠HE切片做出统一的诊断概率较低(49.66%,73/147)。电镜检查三种肿瘤内线粒体数量和结构有明显差异,以此可帮助寻找鉴别诊断依据。透明细胞癌嗜酸变型和乳头状癌恶性程度高于嫌色细胞癌。第二部分：免疫组织化学在诊断肾嗜酸细胞肿瘤中的应用研究目的：研究免疫组织化学在肾脏嗜酸细胞肿瘤鉴别诊断中的意义方法：应用组织芯片技术,将147例肾嗜酸细胞肿瘤制作为组织芯片,并行免疫组织化学染色,检测不同亚型嗜酸细胞肿瘤中的差异表达,以探索对鉴别诊断有帮助的免疫标记物用于临床病理诊断。将147例病例分为2组,一组为73例典型病例(透明细胞癌嗜酸变型14例,嫌色细胞癌嗜酸变型15例,嗜酸细胞腺瘤14例,乳头状癌30例),另一组为74例不典型病例(透明细胞癌嗜酸变型6例,嫌色细胞癌嗜酸变型29例,嗜酸细胞腺瘤33例,乳头状癌6例),以73例免疫组化结果为基础形成免疫组化诊断决策树,并将其应用于74例病例,对比根据免疫组化诊断决策树的诊断结果与原病理诊断结果的符合率。结果：VIM、RCC、P504S、CD117在乳头状癌/透明细胞癌嗜酸变型和嫌色细胞癌嗜酸变型/嗜酸细胞腺瘤中表达有显著性差异。EpCam、MOC31、BerEP4、CK7在嗜酸细胞腺瘤和嫌色细胞癌中表达有显著性差异。CK7、CK19、P504S、MOC31在乳头状癌和透明细胞癌嗜酸细胞变型中表达有显著性差异。将73例典型病例免疫组化结果应用于74例不典型病例,总诊断符合率为79.73%。首次发现EpCam抗体在嗜酸细胞腺瘤中核周围的独特颗粒状染色方式。结论：上述抗体可用于鉴别诊断大部分四种肾上皮嗜酸细胞肿瘤,但仅靠单个抗体难以完成鉴别诊断。第三部分：候选micro RNA肿瘤标记物在诊断肾嗜酸细胞肿瘤中的应用研究目的：在训练组中(Training set)通过比较四种肿瘤的microRNA差异,确立诊断不种病理亚型的界点值(cut off point),并在验证组(validation set)中验证并评估在鉴别不同病理亚型中的诊断价值。方法：运用荧光实时定量PCR (Taqman)在147例石蜡组织标本中对6个候选microRNA进行验证。在训练组(Training set)中应用C-statistics方法,ROC曲线,计算曲线下面积(AUC),确立界点值(cut-off point),在验证组(Validationset)中,使用界点值区分不同肿瘤并验证其在鉴别四种病理亚型中的诊断价值。结果：训练组中hsa-miR-210在乳头状癌和透明细胞癌嗜酸变型中表达显著上调,hsa-miR-221在嗜酸细胞腺瘤和嫌色细胞癌嗜酸亚型中表达明显上调,hsa-miR-200c在嫌色细胞癌中表达明显上调；hsa-miR-126在透明细胞癌嗜酸亚型中明显上调,hsa-miR-31在乳头状癌中明显上调,hsa-miR-139-5p在几种肿瘤中表达无明显差异。在训练组中使用5个microRNA分两步对四种嗜酸细胞肿瘤进行鉴别诊断。第一步：hsa-miR-210和hsa-miR-221把四种肿瘤分两组,嗜酸细胞腺瘤和嫌色细胞癌一组,透明细胞嗜酸亚型和乳头状癌一组。第二步：hsa-miR-200c区分嗜酸细胞腺瘤和嫌色细胞癌；hsa-miR-31和hsa-miR-126区分透明细胞嗜酸亚型和乳头状癌。4个microRNA鉴别的曲线下面积(AUC)均接近0.9,1个microRNA鉴别的曲线下面积(AUC)接近0.8。在训练组中,联合microRNA鉴别诊断四种亚型肾肿瘤的准确率均在0.9左右。在验证组中,联合microRNA鉴别诊断四个亚型肾肿瘤之间的准确率均在0.9以上。结论：5个microRNA标记物在石蜡组织标本中基本能鉴别4种肾上皮嗜酸细胞肿瘤亚型,进一步预示其在不同病理亚型发生发展中起重要作用,其中：hsa-miR-221与肾嗜酸细胞腺瘤和嫌色细胞癌,hsa-miR-200c与嫌色细胞癌关系密切;hsa-miR-210与透明细胞癌嗜酸变型和乳头状癌关系尤为密切,hsa-miR-126与透明细胞癌嗜酸亚型,hsa-miR-31与乳头状癌关系尤为密切。预示5种microRNA可能分别参与了肾嗜酸细胞肿瘤不同病理亚型的发病机制。hsa-miR-139-5p对于鉴别诊断无意义。