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背景:阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是一种多因素的神经退行性疾病,目前尚未发现药物能治愈这种疾病。AD普遍影响65岁以上的老年人,发达地区已经逐步发展成老龄化社会,AD患者的数量也在逐步增长。AD是一种慢性的大脑功能紊乱的退行性疾病,其主要病理特征是神经外周Aβ的聚集,神经纤维缠结,神经元损伤以及突触丢失,最终导致认知和情感功能障碍。然而,AD的确切病因目前任然存在争议,AD的胆碱能假说已经被很好的建立了,这就暗示胆碱能系统对学习和记忆过程都是非常重要的。目前用于临床治疗老年痴呆的多奈哌齐和加兰他敏都可升高乙酰胆碱的水平。然而,多奈哌齐和加兰他敏由于其低效,长期使用致副作用等限制令人不太满意。由于AD是中枢神经系统的多因数疾病,中药的多成分,多靶点治疗可能对于治疗AD更为有效。广州中医药大学DME(Design Measurement Evaluation)补肾益智方(BSYZ)来源于我国著名的中医学教授赖世隆二十多年前主持的国家九·五攻关课题“补肾法为主治疗阿尔兹海默病的研究”。该药方是针对时下愈来愈常见的老年性痴呆症患者的发病机理,总结长期的临床经验,并结合了现代药理学最新的研究成果,而创建的中药复方。补肾益智方(BSYZ)由蛇床子、牡丹皮、枸杞、女贞子、人参、制首乌等多味中药组成,其具有填精补髓,益气养血,活血通络,开窍的功效。前期临床研究显示补肾益智方治疗AD,可增加患者MMSE值(简易智力状况检查法),研究发现补肾益智方可调节IBO致痴呆大鼠的胆碱能系统,NGF信号通路以及抗凋亡的作用。并且补肾益智方可缓解东莨菪碱所致的氧化应激以及细胞凋亡。这些发现都暗示补肾益智方是有效治疗AD的潜在药,然而补肾益智方药效成分复杂,如芍药苷,二苯乙烯苷,丹皮酚,人参皂苷Rg1,人参皂苷Rb1,欧前胡素,蛇床子素,齐墩果酸等,本研究旨在明确补肾益智方有效提取部位对阿尔兹海默病模型小鼠的治疗作用及可能的机制。目的:由于胆碱能神经元的退化导致胆碱能神经传递的缺失被认为是导致AD的主要原因之一,本研究采用东莨菪碱致小鼠记忆障碍模型来研究补肾益智方提取物的药效,在本文研究中,补肾益智方有效部位之一乙酸乙酯提取部位可保护东莨菪碱导致的认知障碍,研究发现乙酸乙酯萃取部位(BSYZ-E)对东莨菪碱致胆碱系统紊乱提供保护作用。本研究旨在探究补肾益智方有效提取部位对东莨菪碱致小鼠记忆障碍模型小鼠的治疗作用,同时试图明确其对上述模型小鼠的作用机制。方法:1.用乙酸乙酯萃取补肾益智方,并用HPLC检测其所含单体成分。2.本研究采用腹腔注射东莨菪碱来制备轻度认知障碍模型(东莨菪碱通过腹腔注射的方式至模型小鼠,剂量为3mg/kg),导致昆明小鼠学习记忆下降。3.选择35至40g的雄性昆明小鼠随机分为正常组,模型组,BSYZ-E低剂量组,BSYZ-E中剂量组,BSYZ-E高剂量组,盐酸多奈哌齐组。BSYZ-E低中高剂量组给药剂量分别为 1.46mg/kg.d、2.92mg/kg · d、5.84mg/kg.d,正常组和模型组以 0.9%生理盐水等量灌胃,阳性药对照组给予盐酸多奈哌齐3mg/kg。每天给药一次,共14天,第8-14天,给药后30min,对昆明小鼠进行腹腔注射东莨菪碱3mg/kg,正常组及对照组注射等量生理盐水,造模30min后进行Morris水迷宫和新物体识别检测小鼠学习记忆能力。4.指标检测(1)用比色法检测各组小鼠脑组织中ACh、AChE和ChAT的水平,Western Blot法检测小鼠脑组织中皮质和海马部分SYN、PSD95、PSD93、BDNF和NGF蛋白表达水平。(2)用TUNEL染色和Nissl染色检测脑组织细胞凋亡和病理学变化,Western Blot法检测小鼠脑组织中Bcl-2、Bax以及Caspase-3的蛋白表达水平。(3)用比色法检测各组小鼠脑组织中iNOS、ROS和MDA的水平。结果:1.HPLC 分析 BSYZ-E水迷宫结果显示补肾益智方乙酸乙酯提取部位比其他有机溶剂提取部位药效最好,并用HPLC对BSYZ-E进行成分分析,建立HPLC图谱,检测波长203nm,确定5种主要有效成分,分别为二苯乙烯苷、丹皮酚、丁烯基苯酞、大黄素和蛇床子素。2.BSYZ-E对东莨菪碱致小鼠学习记忆障碍的影响Morris水迷宫实验结果显示,各组随着训练时间延长定位航行逃避潜伏期时间呈现缩短趋势,与正常组相比,模型组在定位航行测试中逃避潜伏期显著延长(P<0.01),空间探索目标象限停留时间显著减少(P<0.01),穿越平台次数显著减少(P<0.01);与模型组相比,BSYZ-E低中高剂量组定位航行测试中逃避潜伏期均显著缩短(P<0.01,P<0.01,P<0.01),BSYZ-E低中高剂量穿越平台次数显著增多(P<0.05,P<0.01,P<0.01),BSYZ-E中高剂量空间探索目标象限停留时间均明显延长(P<0.01,P<0.01)。新事物识别实验中,与正常组相比,模型组小鼠新事物偏好指数(P<0.05)明显降低,与模型组相比,BSYZ-E以及盐酸多奈哌齐阳性药物对照组偏好指数均有不同程度的上升,各组间总运动路程无明显差异。3.对胆碱能通路的影响与正常组相比,模型组小鼠皮质与海马组织的ACh含量明显下降(P<0.01,P<0.01),AChE 活性显著升高(P<0.01,P<0.01),ChAT 活性降低(P<0.05,P<0.01),与模型组相比,BSYZ-E给药低中高剂量组分别不同程度增加皮质与海马ACh含量,减少AChE活性,提升ChAT活性,差异有统计学意义。4.对神经元功能的影响与正常组相比,模型组小鼠皮质与海马SYN、PSD93、PSD95蛋白的表达量明显减少(P<0.01,P<0.01,P<0.05),BSYZ-E给药不同给药剂量组分别不同程度增加皮质与海马SYN、PSD93、PSD95蛋白的含量。与正常组相比,模型组小鼠皮质与海马BDNF、NGF蛋白的表达量明显减少(P<0.05,P<0.05),与模型组相比,BSYZ-E不同给药剂量组分别不同程度增加皮质与海马BDNF、NGF蛋白的含量。Niss1染色结果显示模型组小鼠脑组织海马CA1区以及皮质区出现神经元空泡变性,尼氏小体减少或消失,细胞核固缩,神经元减少,BSYZ-E各剂量组与模型组相比上述病理改变明显减轻。5.对细胞凋亡的影响与正常组相比,模型组小鼠皮质与海马细胞凋亡蛋白Bax,Caspase-3切割体的表达量明显增加(P<0.01,P<0.05),Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.01),与模型组比,BSYZ-E不同给药剂量组分别不同程度减少皮质与海马细胞凋亡蛋白Bax,Caspase-3切割体的含量,增加Bcl-2蛋白表达。与模型组比,BSYZ-E给药组能够减少TUNEL 阳性细胞数,改善脑组织病理形态学变化。6.对氧化应激通路的影响与正常组相比,模型组小鼠皮质与海马的MDA含量明显上升(P<0.01,P<0.01),ROS活性显著升高(P<0.01,P<0.05),与模型组相比,BSYZ-E不同给药剂量组分别不同程度降低皮质与海马MDA含量和ROS活性。模型组小鼠皮质与海马的iNOS含量比正常组增加(P<0.05,P<0.05),BSYZ-E组iNOS含量比模型组减少。结论:Morris水迷宫测试实验结果证明:用乙酸乙酯提取的BSYZ有效部位在一定程度上改善了东莨菪碱模型小鼠学习记忆能力的下降。BSYZ-E对胆碱能损伤、神经元凋亡、氧化应激损伤和突触功能损伤等有着不同程度的调节作用,起到改善阿尔兹海默病多种病理变化,BSYZ-E可以调节AD相关的多靶点,对老年痴呆有一定的治疗作用,具有较大的挖掘潜力。