大环内酯类抗生素是由链霉菌产生的一类具有内酯环结构的亲脂化合物,具有抗菌活性强、抗菌谱广、用药安全等优点,能够有效治疗呼吸道和软组织感染,在临床上得到广泛应用。然而,细菌耐药问题的出现严重限制了大环内酯类抗生素临床应用的有效性。因此,在杜绝抗生素滥用的同时,开发新型大环内酯类抗生素以对抗各种耐药病原菌是当前亟待解决的问题。大环内酯类抗生素结合于细菌核糖体50S亚基23S rRNA上肽酰转移酶中心的肽出口通道的入口,促进肽酰tRNA在核糖体上的解离,抑制肽链延长,阻断细菌蛋白质的合成,产生抗菌作用。细菌产生耐药的主要原因包括erm基因编码的甲基化酶对药物靶点的修饰和mef基因编码的外排泵蛋白将细胞内的药物泵出胞外。大环内酯类抗生素化学结构复杂,可修饰空间极大。根据其作用机制和耐药机制,对现有大环内酯类抗生素进行结构修饰是开发新型抗菌药物的重要途经。据报道,第二代大环内酯类抗生素克拉霉素C-5位的脱氧氨基糖是发挥抗菌活性的必需基团;C-3位的克拉定糖与细菌核糖体无相互作用,并可能诱导耐药基因mef表达使细菌产生耐药;C-11位修饰目前研究非常少,可能与该位置化学反应活性较差有关。我们先前发现C-11位侧链能与细菌核糖体50S亚基23S rRNA结构域Ⅱ区的核苷酸残基A752结合,有利于提高抗菌活性,特别是抗耐药菌活性。基于上述原因,我们以克拉霉素为母核,保留其活性必需的C-5位脱氧氨基糖,脱除C-3位的克拉定糖并将C-3位羟基氧化成酮,同时在C-11位引入烷芳基三唑氨基甲酸酯侧链,设计11-O-烷芳基三唑氨基甲酰基-3-O-脱克拉定糖-3-酮克拉霉素衍生物。然后,我们以克拉霉素为起始原料,建立了合理的反应路线,经9步反应合成了 3个系列共计35个目标化合物,并通过MS、1H NMR和13C NMR等方法对目标化合物结构进行了表征。采用二倍递减浓度稀释法测定了目标化合物对4种敏感菌和5种耐药菌的体外抗菌活性。测定结果如下:对于4种受试敏感菌株,目标化合物对枯草芽孢杆菌的抗菌活性较好,表现出中等的抗菌活性,活性最好的化合物13f和13i的MIC值为1 μg/mL;对金黄色葡萄球菌表现出轻微的抗菌活性,活性最好的化合物13f和13i的MIC值为4μg/mL;对大肠杆菌和铜绿假单胞菌的抗菌活性较差。对于5种受试耐药菌株,多数目标化合物对ermB型耐药的肺炎链球菌、mefA+ermB型耐药的肺炎链球菌和耐红霉素化脓性链球菌表现出显著提高的抗菌活性,活性最好的化合物13f对上述三种耐药菌的MIC值均为16 μg/mL,比克拉霉素(>256、128、256 μg/mL)提高8-16倍以上,比阿奇霉素(>256、256、256 μg/mL)提高16倍以上。目标化合物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐青霉素金黄色葡萄球菌也表现出有效的抗菌活性,活性最好的化合物13e对上述两种耐药菌的MIC值均为16 μg/mL,比克拉霉素(>256、>256 μg/mL)和阿奇霉素(>256、>256 μg/mL)提高了 16倍以上。总体而言,目标化合物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、耐红霉素化脓性链球菌、ermB型耐药的肺炎链球菌和mefA+ermB型耐药的肺炎链球菌活性较好,对测试的敏感菌和耐药菌MIC值分别可达1 μg/mL和16 μg/mL。所有目标化合物中,化合物13f对上述五种细菌同时表现出最佳的体外抗菌活性,MIC值分别为4、1、16、16、16 μg/mL。与对照药物相比,目标化合物表现出减弱的抗敏感菌活性和显著增强的抗耐药菌活性,其中B系列化合物的抗菌活性显著优于A和C系列化合物。值得注意的是,目标化合物对ermB型耐药肺炎链球菌和mefA+ermB型耐药肺炎链球菌的抗菌活性显著提高。这表明克拉霉素C-3位和C-11位的联合修饰能够克服耐药菌的主动外排作用,提高与细菌核糖体的亲和力,从而对erm和mef型耐药菌产生有效抑制,这与我们的设计思想一致。根据目标化合物的体外活性数据可以总结出以下构效关系:1)对克拉霉素的C-3位和C-11位进行联合修饰,改变了十四元大环内酯母核的空间结构,在部分保留克拉霉素抗敏感菌活性的同时显著提高了抗耐药菌活性;2)11位碳原子与侧链上1,2,3-三氮唑的间隔为6个原子时,化合物分子与细菌核糖体的结合最好,表现出最佳的抗敏感菌活性和抗耐药菌活性;3)烷芳基三唑氨基甲酸酯侧链末端苯环上的取代基对活性影响大:吸电子基取代能够提高抗菌活性,多数给电子基取代对抗菌活性不利;芳基取代和长链烷基取代对化合物的抗菌活性产生有利影响,其中直链烷烃优于支链烷烃;卤素原子取代对抗菌活性产生影响,其中氯原子优于氟原子和溴原子;取代基的位置对化合物抗菌活性几乎无影响。体外杀菌评价揭示了目标化合物通过抑菌作用对敏感菌株和耐药菌株发挥抗菌作用。杀菌动力学研究进一步从微观角度证实化合物13i是浓度依赖性抑菌剂。分子对接结果表明,化合物13i具有与克拉霉素相似的结合模式,除保留了克拉霉素C-2位羟基与细菌核糖体50S亚基23S rRNA结构域V区A2058的氢键作用外,其C-11位烷芳基三唑氨基甲酸酯侧链不仅能与结构域Ⅱ区的A752和U790核苷酸残基形成氢键,还能与结构域V区的G2505、C2610和C2611形成的口袋产生相互作用,提高了对耐药菌的抗菌活性。