日本沼虾(Macrobrachium nipponinse),俗名青虾,自然分布于中国、日本、越南以及缅甸等地区,广泛分布于我国各地淡水水域。是我国最重要的淡水经济虾类之一。在养殖水体中,亚硝酸盐含量是影响日本沼虾生长发育的最重要的水质指标之一,研究和揭示日本沼虾抵抗亚硝酸盐胁迫的分子机制,可以为培育抗逆性强的个体奠定基础;为日本沼虾养殖业的发展,尤其是提高养殖成活率提供重要依据。近几年,Illumina高通量测序技术成为各物种转录组分析鉴定的有力工具,在虾类研究中,与低氧胁迫相关的高通量测序已有报道,但与亚硝酸盐相关的基于Illunina平台测序方面的研究尚未见报道。本研究将日本沼虾饲养于亚硝酸盐浓度为10mg/L(96LC-50)的环境下,48h时提取其肝胰腺,并与正常饲养条件下虾的肝胰腺为对照,进行高通量测序和比对检测。主要研究结果如下:(1)10mg/L浓度的亚硝酸盐胁迫48h后,日本沼虾肝胰腺与对照组沼虾的肝胰腺高通量测序结果显示,经过测序质量控制,共得到34.68Gb Clean Data,各样品Q30碱基百分比均不小于86.33%,各样品Clean Data均达到5.37Gb,De novo组装后共获得56,054条Unigene。其中长度在1kb以上的Unigene有14,373条。对Unigene进行功能注释,包括与NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam数据库的比对,共获得19,022条Unigene的注释结果。进行基因在各样品中的表达量分析。基于基因在不同样品中的表达量,识别差异表达基因。对差异表达基因进行模式聚类、功能注释以及富集性分析。(2)选择15个差异表达的unigenes,用qRT-PCR验证了在胁迫组和正常组中的表达差异,结果显示,荧光定量检测结果与测序结果的表达趋势相一致。进一步对差异表达基因进行生物信息学分析,选取与免疫相关的影响细胞信号转导通路的关键基因进行功能研究。(3)选取Guaninenucleotide-binding protein和Lysosome两种关键基因,分别检测了其肝胰腺在亚硝酸盐胁迫下不同时间段(4h,10h,24h,48h,72h,96h)的mRNA表达量,结果显示Lysosome基因在4h时出现表达,10h时表达量最高。Guaninenucleotide-binding protein基因在10h和48h时表达量均达到峰值。这两种基因在48h时的肝胰腺、鳃和肌肉三种组织中有不同的表达量,其都在肌肉中的表达量最高,两种基因在对抗亚硝酸盐胁迫时在肌肉组织中的表达最为活跃。(4)对正常饲养条件下的日本沼虾和亚硝酸盐胁迫下的肝胰腺进行组织学比较,电镜观察结果显示,随着亚硝酸盐胁迫时间的增加,肝胰腺细胞逐渐出现坏死现象,管壁细胞与基膜分离,严重时管壁破裂,这说明亚硝酸盐胁迫会损伤或破坏肝胰腺的组织结构,进而会影响肝胰腺的生理功能,影响动物体内酶的催化作用和细胞膜的稳定性,进而破坏渗透压的平衡。胁迫48h时,粗面内质网上的核糖体颗粒开始大量脱落,内质网严重水肿,线粒体内部局部瓦解,线粒体双层膜溶解,出现电子透明区,部分趋于解体;微绒毛变形和少数破损,表明久效亚硝酸盐对肝胰脏已构成了较大的损伤和破坏,随着处理时间的延长,对细胞器的损伤越来越严重。综上所述,本研究对日本沼虾转录组进行测序,获得了大量的转录组信息,为日本沼虾的转录组研究提供了基础数据。选择一些关键基因,得到了其在各组织中的差异表达情况,进一步对差异表达基因进行了研究,推测出在抗亚硝酸盐胁迫中的关键基因,研究结果为揭示日本沼虾耐受亚硝酸盐胁迫的分子和细胞遗传机制和提高其耐受性奠定了基础和提供了重要数据。