白藜芦醇对PC12细胞增殖内稳态影响的研究

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研究目的:组蛋白去乙酰化酶(sirtuin1,SIRT1)是沉默信息调节因子2(silenceinformation regulator2,Sir2)家族成员之一,依赖NAD+(nicotinamide adeninedinucleotide,NAD+)的去乙酰化,维持细胞的增殖、分化、凋亡等不同生理过程。白藜芦醇(Resveratrol,Rev)是SIRT1的激活剂,不同细胞对白藜芦醇敏感程度不一,对同一类型细胞,不同剂量白藜芦醇的处理,实验结果也存在差异。本文研究了白藜芦醇对PC12细胞增殖内稳态的影响及其作用机制。   研究方法:分别对低糖(low glucose,lG)(10 mM)、正糖(normal glucose,nG)(25mM)和高糖(high glucose,hG)(90 mM)条件培养下的PC12细胞,给予不同剂量白藜芦醇处理(0、0.1、1、5、10、50、100μM),研究Rev对PC12细胞增殖的影响,噻唑蓝(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium brom-ide assay, MTT)在第48h进行细胞增殖活性检测。   将10 mM葡萄糖常规培养的未分化PC12细胞,给予不同剂量Ex-527(0、0.1、0.5、1、1.5、2μM)处理,研究其对PC12细胞增殖的影响,24 h、48 h、72 h、96 h后采用MTT法进行细胞活性检测;将细胞分成对照(Cont)、DMSO、Ex-527(1μM)和白藜芦醇(Rev,50μM)共四大组,用不同浓度葡萄糖(0、10、20、25、30、50、90 mM)进行培养,96h后MTT法检测细胞增殖活性。   对低糖(low Glu,LG)10 mM、常糖(normal Glu,NG)25 mM分别常规培养的未分化PC12细胞,给予不同浓度葡糖糖(10、25、30、90 mM)及0、50μM浓度的白藜芦醇培养48 h、96 h后,用MTT法检测各组细胞的增殖活性。   将25 mM葡萄糖常规培养的未分化PC12细胞换成低糖lG、正糖nG、高糖hG培养,分别添加0、50μM白藜芦醇和等体积分数二甲基亚砜DMSO(control组、Rev组、DMSO组),于12h、72 h后收样,采用MTT法,酶循环比色法检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)和其还原形式(reduced form ofNAD+,NADH)比值,蛋白质免疫印迹法(Western blotting,WB)分析各组SIRT1蛋白表达水平、实时聚合酶链式反应(real-time reverse transcription polymerase chainreaction,RT-PCR)检测各组Sirt1、FoxO3a mRNA表达水平。   研究结果:   1.体积分数小于0.1%的DMSO对PC12细胞的增殖无影响,但却提高细胞内NAD+/NADH的比值和SIRT1蛋白表达水平。与对照组相比,1、5、10、50μM浓度的白藜芦醇能显著提高lG、nG、hG条件下培养的PC12细胞增殖活性(P<0.05),其中50μM浓度的白藜芦醇促进增殖作用有极显著性差异(P<0.01)。   2.浓度在0.5-2μM间的EX-527对PC12细胞的增殖活性有不同程度的影响。   3.常规培养用NG(25 mM)的PC12细胞,对应浓度葡萄糖组的增殖活性均比常规培养是LG(10 mM)的细胞组显著性低(P<0.05)。10 mM Glu常规培养的PC12细胞与25 mM Glu常规培养的细胞组中,均是25 mM葡萄糖组细胞增殖活性最高(P<0.05),10 mM葡萄糖组及90 mM葡萄糖组条件下细胞增殖活性降低。   4.培养12h时,lG条件下,Rev组(50μM Rev)细胞内NAD+/NADH的比值比DMSO组(0.1% DMSO)和对照组都显著升高(P<0.01); nG条件下,各组间无显著性差异;hG条件下,Rev组和DMSO组都比对照组要低(P<0.01),Rev和DMSO组间无显著性差异。培养72 h时,不同浓度糖条件下,Rev组、对照组、DMSO组间细胞内NAD+/NADH的比值无显著性差异。   5.各糖浓度条件下,DMSO组SIRT1蛋白表达水平都比对照组高。培养12h时,Rev组细胞内SIRT1蛋白表达水平在各糖浓度条件下均比DMSO组低,与对照组无明显区别;nG对照组培养的PC12细胞SIRT1蛋白表达水平低于hG对照组,高于lG对照组。培养72 h时,lG和nG条件下,对照组、DMSO组、Rev组细胞内SIRT1蛋白表达水平依次上升;hG条件下,各组SIRT1表达水平无明显差异;nG对照组织培养的(PC12)细胞SIRT1蛋白表达水平均高于hG对照组和lG对照组。   研究结论:白藜芦醇对PC12细胞增殖的影响存在最佳浓度(——)50μM浓度(白)黎芦醇有极显著促增殖作用,其浓度过低或过高时对PC12细胞的影响效果都降低,甚至出现抑制增殖作用,符合安-舒二氏定律(Arndt-Schulz law)。正糖nG25 mM维持PC12细胞葡萄糖增殖内稳态(proliferation-specific homeostasis,PISH),lG或hG打破PISH,应激引起SIRT1蛋白水平升高,抑制细胞的增殖,白藜芦醇能抵抗这种升高,促进细胞增殖,同时能使处于PISH的PC12细胞成功应激,SIRT1蛋白水平上升,细胞增殖活性显著性升高,细胞抵抗糖浓度干扰能力增强,建立新的更高品质的PISH。
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