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中耳胆脂瘤，是耳科常见多发疾病，典型的中耳胆脂瘤由三部分组成，囊袋基质结构、囊内容物及囊带基质周围组织，是一种非真性肿瘤。具有肿瘤的某些生物学特性，如独立持续的增殖性、侵袭破坏性、复发性等局部膨胀性生长特征，但不具经淋巴、血液的远灶转移性。病变持续膨胀性生长，加之酶类腐蚀破坏作用，邻近骨质吸收破坏可导致颅内外一系列并发症，如颞骨内并发症如迷路炎、岩锥炎及耳源性周围性面瘫；颅外并发症如颈深部脓肿、经血源性感染途径的肺脓肿等；颅内并发症如脑脓肿、脑膜炎、耳源性脑水肿等，严重者脑疝形成危及生命。手术是目前治疗中耳胆脂瘤唯一有效方法。
p38丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogen activated protein kinase p38MAPK)信号传导通路是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase MAPKs)信号传导系统的重要组成部分，在细胞增殖、分化、炎症、应激过程中发挥重要的作用。p38MAPK是p38MAPK信号转导通路的关键酶，可在多种条件下激活，如炎性细胞因子：肿瘤坏死因子—α(tumor necrosis factor—α TNF—α)、白细胞介素一1(interleukin-1 IL-1)、白介素—6(interleukin—6 IL—6)、细菌坏死崩解产物、紫外线照射、应激条件、细胞外高渗状态等。
中耳胆脂瘤内存在细菌感染，周围肉芽组织存在多种炎症免疫细胞，分泌表达多种炎性细胞因子，胆脂瘤囊袋基质上皮组织内亦存在多种细胞因子表达，胆脂瘤囊内容存在鳞屑组织、LPS等内容物。上述条件可能成为激活胆脂瘤上皮中p38MAPK信号转导通路的重要因素。但目前有关p38MAPK信号传导通路在中耳胆脂瘤病理机制中的作用的研究较少，本课题通过生物体外试验，用胆脂瘤囊内容物萃取液干预HaCaT细胞，观察HaCaT细胞受干预后的增殖情况，并检测期间p38MAPK信号通路的激活与表达情况，初步探讨p38MAPK信号途径在胆脂瘤病理机制中的作用和意义。
研究目的：用胆脂瘤囊内碎屑组织萃取液干预HaCaT细胞，以模拟简易胆脂瘤上皮细胞生长微环境，建立体外胆脂瘤上皮细胞增殖模型，检测是否存在p38MAPK的激活与表达，探讨p38MAPK信号通路在中耳胆脂瘤病理机制中的作用。
研究方法：
HaCaT细胞株培养传代：HaCaT细胞(人永生化表皮细胞，购置于中国科学院广州分院)，传代培养。
胆脂瘤囊内碎屑组织萃取液的制备：术中收集胆脂瘤囊内容物组织，急送—80℃冷存。试验时取出后，放置于匀浆器中，加少许液氮，快速研磨成粉状，溶于无菌磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution PBS)中，低温12000转/min离心20 min，留取上清，滤过除菌。进行Bradford法蛋白定量。
试验一：胆脂瘤囊内碎屑组织萃取液对HaCaT细胞增殖影响：对照组无菌PBS干预HaCaT细胞，实验组1、2、3组分别按胆脂瘤囊内碎屑组织萃取原液、1：10稀释原液、1：100稀释原液干预HaCaT细胞，细胞生长48小时以MTT法检测各组细胞数及活性。
试验二：磷酸化p38MAPK在HaCaT细胞表达的定性试验：对照组：无菌PBS干预HaCaT细胞，实验组胆脂瘤囊内碎屑组织萃取原液干预HaCaT细胞，用免疫组化的方法检测干预后5min、10min、15min、20min、25min、30min磷酸化p38MAPK在HaCaT细胞的表达。
实验三：p38MAPK在HaCaT细胞mRNA水平的表达定量分析：对照组无菌PBS干预HaCaT细胞，实验组1和实验组2分别为：按胆脂瘤囊内碎屑组织萃取原液、1：2稀释原液干预HaCaT细胞，干预后30min收集细胞提取mRNA，进行逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription—polymerase chain reaction RT—PCR)定量分析p38MAPK在HaCaT细胞mRNA水平的表达。
试验四：p38MAPK信号通路特异性抑制剂SB203580对胆脂瘤囊内碎屑组织萃取液促进HaCaT细胞增殖的影响：胆脂瘤囊内碎屑组织萃取原液干预HaCaT细胞前30min加入SB203580，0μmol/L——对照组，2.5μmol/L组，5μmol/L组，10μmol/L组，20μmol/L组。48小时以MTT法检测各组细胞数及活性。
结果：试验一：胆脂瘤囊内碎屑组织萃取液干预HaCaT细胞后48小时MTT检测OD值：对照组：0.205±0.021，实验组1：0.654±0.011，实验组2：0.413±0.029，实验组3：0.246±0.011，各实验组平均OD值明显高于对照组，对照组与各实验组间差异有统计学意义(p=0.000)。实验组OD值呈胆脂瘤囊内碎屑组织萃取液干预浓度依赖性增高，各实验组间差异有统计学意义(p=0.000)。
试验二：免疫组化结果提示：从10min开始出现胞浆阳性，30min时见明显的胞核阳性，对照组胞核未见阳性染色。
实验三：p38MAPK在HaCaT细胞mRNA水平的表达结果：RT—PCR琼脂糖明胶电泳灰度值分析对照组、实验组1及实验组2，其灰度值分别为0.216±0.027，0.828±0.019，0.522±0.023。两实验组平均灰度值均明显高于对照组，两实验组与对照组差异有统计学意义(p=0.000)，实验组1平均灰度值明显高于实验组2，组间差异有统计学意义(p=0.000)。
试验四：p38MAPK信号通路特异性抑制剂SB203580对胆脂瘤囊内碎屑组织萃取液粗经HaCaT细胞增殖的影响，MTT检测OD值：对照组0.535±0.008，2.5μmol/L组：0.527±0.012，5μmol/L组：0.504±0.017，10μmol/L组：0.476±0.012，20μmol/L组：0.470±0.013。对照组与2.5μmol/L组间差异无统计学意义(p=0.379)，与5μmol/L组、10μmol/L组、20μmol/L组差异有统计学意义(p<0.05)，10μmol/L组与20μmol/L干预组间差异无统计学意义(p=0.507)。
结论：本题建立胆脂瘤生物体外研究模型。用胆脂瘤囊内碎屑组织萃取液干预人永生化表皮细胞(HaCaT细胞)，发现p38MAPK被激活及p38MAPK在HaCaT细胞mRNA水平表达上调；胆脂瘤囊内碎屑组织萃取液可刺激HaCaT细胞的增殖，且能被p38MAPK特异性抑制剂不同程度的抑制。由此可见p38MAPK信号传导通路的激活与体外模拟简易胆脂瘤微环境中HaCaT细胞的增殖密切相关。因此初步认为在胆脂瘤病理过程中，p38MAPK信号通路受多种刺激因子而激活和表达，并可能在调节胆脂瘤上皮细胞的增殖过程发挥重要作用。
关于p38MAPK信号通路在胆脂瘤上皮中激活后，作用何种底物及如何调节下游产物，以及其在胆脂瘤分化、增殖及引起周围骨质破坏病理过程中的确切分子机制尚不明确，仍有待深入研究。我们将进一步完成人胆脂瘤上皮的原代细胞培养，明确胆脂瘤中炎症刺激的免疫机制表达与p38MAPK信号通路对胆脂瘤上皮细胞增殖过程的调节；探讨术中获取外耳道、中耳不同部位及明显胆脂瘤浸润部位与邻近周边组织的磷酸化p38MAPK表达的情况；复制中耳胆脂瘤动物模型，进行生物体内实验，深入探讨p38MAPK在胆脂瘤上皮增殖机制中的作用。