柚皮甙诱导BMSCs复合生物衍生骨构建组织工程骨的实验研究

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目的:(1)利用改良法制备廉价易得、生物相容性好的生物衍生骨材料。(2)对生物衍生骨材料在体内的降解性及异位成骨能力进行评价,为生物衍生骨作为骨组织工程支架材料的研究提供实验依据。(3)检测柚皮甙体外诱导成骨能力,为其成为新药提供理论支持。  方法:选用5月龄新西兰大白兔双侧髂骨,采用双氧水脱蛋白、超临界 CO2法脱脂、超声波清洗、深低温冷冻后,制成5 mm×5 mm×3 mm大小的生物衍生骨支架材料,对其理化性质及生物相容性进行检测;采用全骨髓贴壁法获得新生兔的骨髓间充质干细胞,收集纯化、传代培养后第三代骨髓间充质干细胞,以5×105/ml的浓度接种到生物衍生骨材料上,CO2培养箱中孵育4小时后,加入柚皮甙诱导培养液培养7天后,植入成年新西兰大白兔大腿肌袋内,进行异位成骨、体内溶解性及免疫性研究;用SPSS13.0统计软件对相关实验数据进行统计学分析。  结果:(1)支架孔隙率为(80.23±5.65)%,孔径最大径为(318.112±17.51)μm,最小径为(209.37±11.33)μm。pH为7.383±0.015,与对照组相比无统计学意义(P>0.05)。生物衍生骨材料中蛋白质含量为0.98%±0.08%。未发现细菌或霉菌生长。12周时生物衍生骨材料降解率达90%以上。热原试验结果示生物衍生骨材料无致热作用;生物衍生骨材料的溶血率为0.43%(5%),提示无溶血现象发生;无细胞毒性;细胞接种支架24小时后黏附率均达85%以上;接种5天后有较多细胞外基质分泌,电镜观察接种5天时细胞外基质分泌呈胶状物,并逐渐增多,到15天时,部分空隙被填满。(2)支架体内植入试验中:4周时实验组部分生物衍生骨材料开始降解吸收,有纤维肉芽组织长入,少量新骨形成;8周后生物衍生骨材料降解加快,不断被新骨代替,12周时的骨小梁较8周时成熟,边缘可见片状新生骨;而对照组4周时植入物开始降解吸收,纤维结缔组织长入,未见成骨细胞,8周后支架材料进一步降解吸收,到12周时见少许浅色均质的片状支架材料残留,纤维结缔组织充填包绕,仍未见有新骨形成。  结论:(1)采用双氧水脱蛋白、超临界CO2法脱脂、超声波清洗、深低温冷冻后制备的生物衍生骨材料制作简单,理化性质稳定,具有原始骨组织的三维结构,无细胞毒性、无溶血性,有良好的生物相容性和细胞-材料界面作用,是一种良好的骨组织工程支架材料。(2)柚皮甙诱导的BMSCs复合生物衍生骨支架在兔体内成功构建了组织工程化骨,且异位成骨能力与降解速度相匹配。
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