金龟子绿僵菌侵染东亚飞蝗翅膀和血淋巴时期基因的鉴定

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金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)是一类应用广泛的昆虫病原真菌,在昆虫防治中起着重要作用。与化学农药相比,真菌杀虫剂尽管安全,专一性好,无环境污染,但存在着杀虫速率慢的弱点,这在很大程度上阻碍了真菌杀虫剂的应用。金龟子绿僵菌侵染寄主昆虫时,孢子萌发后会形成附着胞——一种重要的侵染器官,能够分泌多种蛋白酶降解昆虫体壁,并产生膨胀压帮助侵染钉刺穿体壁。侵入体内后,为了逃避寄主自身的免疫保护反应,金龟子绿僵菌会发生形态改变并适应体内的高渗透压,同时消耗寄主的营养提供自己生长,最后致死寄主。附着胞的形成及分化及其体内定殖阶段在金龟子绿僵菌侵染过程中发挥着重要作用,对这两个阶段病原真菌的致病机制研究可为发展新型高效真菌杀虫剂提供依据。国内外许多研究者对绿僵菌侵染昆虫体表和体内的基因进行了深入研究,采用的方法是往液体培养基中加入昆虫表皮提取物或者直接用无寄主血细胞的淋巴来培养绿僵菌,然后构建绿僵菌的cDNA文库进行EST测序分析。绿僵菌在离体的液体培养环境下生长时处于腐生生活阶段,而绿僵菌在侵染昆虫体表时处于寄生生活阶段,在这两种生长条件下绿僵菌的基因表达谱肯定会存在较大差别。本文用金龟子绿僵菌CQMa102为模式生物,一方面以生长于东亚飞蝗翅膀,且处于附着胞形成分化阶段的材料作为Tester,而以体内定殖阶段的材料为Driver,采用抑制消减杂交方法构建消减文库;另一方面用体内定殖阶段的绿僵菌作为实验材料,用SMART技术构建cDNA文库。通过测序和生物信息学分析,为后期的毒力基因鉴定提供候选基因。主要研究结果如下:1.选择金龟子绿僵菌CQMa102在蝗虫翅膀生长的材料为Tester,在蝗虫体内定殖时期的材料为Driver,采用抑制消减杂交方法成功构建消减文库;2.随机从差减文库中挑取1890个克隆进行斑点杂交筛选,得到460个阳性克隆,测序获得329条质量较好的ESTs,代表78条非冗余序列;3.在GenBank上用BLASTx对其进行序列同源性比对。结果表明32条ESTs编码产物与己知蛋自质序列同源性较低或找不到任何同源序列,46条ESTs与数据库中已知蛋白序列有明显的同源性,其中24条己知功能的同源ESTs涉及多种代谢和应答过程,包含在细胞代谢、蛋白代谢、细胞结构与功能以及参与胁迫和抵抗等方面;4.采用RT-PCR方法验证SSH的结果,结果表明随机选择的12条EST序列均在蝗虫翅膀生长分化阶段差异表达,从而验证SSH结果的有效性;5.收集绿僵菌在蝗虫体内定殖时期(包括第3、4、5、6、7天混合有血淋巴细胞的菌体)的材料,再从中分离得到纯净的菌体,以此为材料采用SMART技术构建全长cDNA文库;6.通过斑点杂交方法从全长cDNA文库中筛选克隆测序,共获得396个单克隆,生物信息学分析表明共有318条质量较好的序列,代表187条unigenes,其中有22条序列跟已知功能基因相似度较高(E≤1e-5),分别包含在细胞代谢、蛋白代谢、细胞结构与功能以及参与胁迫和抵抗等方面。
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