体细胞克隆又称体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer,SCNT）,是家畜优良种质高效扩繁和育种新材料创制的重要手段,在家畜遗传改良上具有重要的应用价值。在猪育种中,利用SCNT技术可以将优秀种公猪个体进行复制扩繁,生产出与供体同样优秀的克隆个体。除此之外,SCNT与转基因或基因编辑技术相结合,可以创制具有优势性状的猪育种新材料。然而,目前猪SCNT效率依然低下,主要原因是体细胞表观遗传重编程不完全,从而导致胚胎发育过程中关键基因异常表达。本研究拟揭示猪克隆胚胎早期发育异常的分子机理,寻找导致猪克隆胚胎早期发育被阻滞的关键基因,探索提高猪克隆效率的新方法。本研究采用单细胞转录组测序技术,构建了猪克隆与体内受精胚胎在7个连续发育阶段（卵母细胞、1-细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚、囊胚期）的基因表达图谱,发现猪胚胎基因组激活主要发生在2-细胞至8-细胞阶段;鉴定到多个导致猪克隆胚胎发育异常的候选基因,其中TET1、DRAP1是影响猪体外成熟卵母细胞发育潜能的关键基因,KLF17、OLIG3、ZFP37、ZFP42是影响克隆猪4-细胞胚胎基因组激活的关键基因;通过比较猪克隆和体内受精胚胎的H3K4me3、H3K9me3和H3K27me3相关组蛋白甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶基因表达变化模式,发现KDM4A、KDM4D和KDM5B在4-细胞克隆胚胎中异常低表达,KMT2A、SUV39H2在8-细胞克隆胚胎中异常高表达,这些基因表达异常可能是导致猪克隆胚胎的组蛋白修饰异常的重要原因。本研究进一步采用单细胞全基因组甲基化测序技术,构建了猪4-细胞和8-细胞的克隆与体内受精胚胎的单碱基分辨率的DNA甲基化图谱。通过比较4-细胞期的克隆与体内受精胚胎的甲基化模式,鉴定到7738个差异甲基化区域,其中6403个为高甲基化区域,1335个为低甲基化区域,表明猪4-细胞克隆胚胎中不仅有大量异常的高甲基化区域,而且还有很多异常低甲基化区域;8-细胞期的克隆与体内受精胚胎之间共鉴定出24791个DMRs,其中24014个为高甲基化区域,777个为低甲基化区域,表明猪8-细胞克隆胚胎的DNA甲基化异常主要是存在大量异常高甲基化区域;KEGG通路分析发现4-细胞和8-细胞的克隆与体内受精胚胎的差异甲基化基因主要富集在NF-κB信号通路和氧化磷酸化信号通路中,在细胞分化、增殖和凋亡过程中发挥重要作用。最后,本研究在1-细胞克隆胚胎中过表达KDM4A/KDM5B/KDM6B/USP21/USP29等基因,探索抑制组蛋白甲基化或泛素化水平对猪克隆胚胎发育效率的影响。结果发现同时过表达KDM4A和KDM5B极显著提高囊胚率和囊胚内总细胞数;单独过表达KDM4A、KDM5B或USP29仅极显著提高囊胚内总细胞数,对囊胚率无显著影响;单独过表达USP21、KDM6B对囊胚率和囊胚内总细胞数均无显著影响。利用转录组测序分析发现过表达KDM4A、KDM5B或同时过表达KDM4A和KDM5B均矫正了部分在对照组克隆胚胎中异常的表观遗传修饰相关的功能基因表达,这些基因显著富集在组蛋白赖氨酸代谢通路中。通过免疫荧光染色分析发现过表达KDM4A显著降低2-细胞、4-细胞和8-细胞的克隆胚胎的H3K9me3荧光信号,过表达KDM5B显著降低2-细胞和4-细胞的克隆胚胎的H3K4me3荧光信号,同时过表达KDM4A和KDM5B引起H3K9me3和H3K4me3荧光信号均显著降低。通过联合注射体外合成的KDM4A mRNA和KDM5B mRNA至1-细胞胚胎的方法,使克隆猪的出生效率提高了1.96倍。本研究通过比较猪早期克隆和体内受精胚胎的转录组和DNA甲基化图谱,解析了猪克隆胚胎早期发育的异常模式;通过在猪克隆胚胎中过表达组蛋白去甲基化酶基因KDM4A和KDM5B,显著提高了猪体细胞克隆效率。本研究为进一步理解猪克隆胚胎发育异常提供了重要的理论基础,为提高猪体细胞克隆效率提供了新的思路。