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杆状病毒展示系统(Baculovirus Display System,BDS)是一种优秀的真核生物表面展示系统,具备安全、高效和经济等优点。由于杆状病毒载体对哺乳动物安全,兼具基因表达水平高、蛋白修饰完善等特点,BDS被广泛应用于抗原呈递、基因治疗和基因工程疫苗等领域。近年来研究发现,BDS的应用和推广主要受到如下4个方面的限制:(1)传统BDS利用目标基因与Class Ⅲ型囊膜蛋白基因的融合表达,实现目标蛋白囊膜展示的同时,杆状病毒自身Class Ⅲ型囊膜蛋白也高量表达,从而产生2种囊膜蛋白之间的强烈竞争,导致目标蛋白的展示效率低;(2)由于转移载体和外源基因引入方式等限制,BDS多局限于单一/双目标蛋白的研究,针对多目标蛋白的融合共展示研究尚无深入探索;(3)传统BDS一般使用病毒极晚期活性启动子介导融合基因的表达,启动子表达时序性差异同样引起蛋白竞争、降低展示效率,且杆状病毒启动子具有典型的宿主蛋白依赖性,在多数非宿主细胞内不具有表达活性;(4)囊膜蛋白可介导杆状病毒转导哺乳动物细胞,但转导效率较低,无法满足BDS的应用需求。因此,提高BDS展示效率、深入探索多目标蛋白的共展示能力、筛选出一种不依赖宿主细胞特异性转录因子的极早期高效表达启动子和提高杆状病毒对非宿主细胞转导效率,成为BDS系统亟待开发应用的关键因素。该研究首先筛选并设计出含有博莱霉素抗性基因(ZeocinR)的同源重组基因gp64F-ZeocinR-gp64R,Red-gam重组等技术构建gp64基因缺失型菌株E.coli Ac Multi Bac/Δasd Sw106/PGB2ΩInv/Δgp64(Sw106-Δgp64),并基于Sw106-Δgp64重组菌确定了囊膜蛋白GP64的缺失将导致重组杆状病毒无法完成出芽、成熟等过程;内部核糖体进入位点序列(Internal Ribosome Entry Site,ires)介导的荧光素酶(Luciferase)表达量测定结果表明,ires在昆虫sf9细胞的表达效率显著低于上游启动子的直接作用,12 h.p.i达到差异极显著水平(p<0.01);且ires补偿表达方式的引入,可显著降低野生型GP64的表达量,并拯救重组杆状病毒完成复制循环;TEM检测也表明低GP64组装对重组病毒粒子的滴度、复制周期和形态结构等无显著影响。其次,为探究ires介导GP64低量表达对BDS展示效率和展示能力的提升,基于Sw106-Δgp64重组菌的Luciferase和荧光蛋白融合展示测定结果表明,ires介导的GP64低量表达可将Luciferase的展示效率提高约5倍(p<0.01);LSCM和Western Blot检测结果显示,Zero-Background Tn7和Cre-loxP特异性转座,成功实现了3种荧光蛋白(GFP、mCherry和YFP)稳定、高效的共展示在sf9细胞和重组病毒囊膜表面。基于启动子表达时序性研究,系统测定了杆状病毒启动子(p10、p64、pvp39)和哺乳动物细胞活性启动子(pcmv、psv40、pie1)在昆虫sf9、BHK-21和293T细胞的表达效率,并筛选出杆状病毒极早期活性启动子p64和非病毒蛋白依赖性启动子WSSV-pie1可介导融合基因的高效表达和展示;此外,结合流式细胞术,验证了Invasin和VSVG在病毒囊膜的修饰作用,可提高重组病毒粒子对非宿主细胞(BHK-21、293T)的转导效率。最后,利用Sw106-Δgp64重组菌和ires介导的野生型GP64低量表达等方式,成功构建出一种高效率、共展示4种目标蛋白(PCV2-Cap、PRRSV-Gp5、CSFV-E2、Invasin)的重组杆状病毒,Western Blot和囊膜抗原ELISA检测结果表明,4种目标蛋白的展示效率相较于传统BDS均有极显著提升(p<0.01);以BALB/c小鼠为模型,进一步验证了Sw106-Δgp64系统和ires-V5gp64补偿表达等方式,比传统BDS可诱导小鼠产生更高水平的特异性抗体(p<0.01)。综上所述,该研究成功构建了一种gp64基因缺陷型E.coli Ac Multi Bac/Δasd Sw106/PGB2ΩInv/Δgp64,通过ires介导GP64低量表达等方式,在不影响重组病毒滴度、复制周期和病毒形态的基础上,显著提高了多目标蛋白的囊膜展示效率和展示稳定性;利用启动子表达时序性,实现了杆状病毒极早期活性启动子p64和非病毒蛋白依赖性启动子pie1介导融合基因的高效表达;利用Invasin、VSVG对病毒囊膜的修饰,进一步提高了重组病毒对非宿主细胞的转导效率。基于上述研究构建出一种新型、多目标蛋白高效共展示的重组杆状病毒,成功应用于BALB/c小鼠,系统性探索了Sw106-Δgp64-ires-V5gp64应用于多蛋白高效共展示、多联疫苗等领域的开发前景,为BDS的发展奠定研究基础。