一、研究背景　　 丙泊酚由于其起效快、麻醉状态可控性强、维持时间短、苏醒迅速及持续输注后无蓄积等特点被广泛应用于麻醉诱导、维持及ICU镇静。丙泊酚全麻机制的研究也一直是国内外麻醉学家们研究的热点。到目前为止，研究认为麻醉药发挥作用主要与突触上的离子通道及中枢神经系统中关键部位的膜蛋白有重要关系。　　 丙泊酚可通过影响氨基酸类神经递质的释放和传递，进而影响突触上离子通道的活性，最终达到抑制神经冲动传导的目的。氨基酸类递质主要包括γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)及谷氨酸(Glu)，其中GABA、Gly为抑制性神经递质，Glu为兴奋牲递质。GABA是中枢最主要的抑制性神经递质，当丙泊酚与靶点结合后可使受体激活，氯离子通道开放，大量的氯离子内流产生抑制性突触后电位，从而抑制兴奋性动作电位的传导。Gly也是重要的抑制性神经递质，丙泊酚可以浓度依赖地增强Gly诱发的氯离子内流，快速抑制突触传递。Glu是中枢神经系统最重要的兴奋性氨基酸递质，可与N-甲基-D-天门冬氨酸受体(NMDA)结合，引起大量Ca2+内流，产生长时程兴奋性突触后电位(EPSP)。离体实验表明丙泊酚选择性抑制大脑皮质神经元持续性钠电流和L型钙通道的电导性，减少阳离子如Na+、Ca2+的内流，这种作用可以增强GABA的大脑抑制作用。　　 综上，我们发现，无论丙泊酚影响哪一种氨基酸类神经递质与受体的结合，其后续的作用机制都与离子通道有着密不可分的联系。Kondratyuk等利用鼠脑突触体研究了cAMP信使系统和钙信号系统对钠通道的调节，发现去极化可导致钠通道磷酸化的增强，并且这种增强作用是由于去极化引起的钙离子内流激活了蛋白激酶C(PKC)，PKC促进cAMP依赖的蛋白磷酸化，并抑制其脱磷酸化。在所有的翻译后修饰中，磷酸化及去磷酸化是重中之重，几乎调节着细胞信号转导、细胞分化、细胞生长、细胞凋亡等所有的生命活动。蛋白质磷酸化的异常往往导致细胞生命活动的异常，有研究证明阿尔兹海默病与脑组织中tau蛋白异常磷酸化密切相关;动物吸入异氟醚、七氟醚等可使tau蛋白磷酸化升高，这或许与使用麻醉药后短暂的认知功能障碍有关。因此，探索丙泊酚输注后蛋白质磷酸化的变化规律对于寻找丙泊酚麻醉机理可能会有很大的帮助。　　 功能蛋白质组学可以通过寻找不同生命过程或不同状态下出现的差异蛋白，高效率的找到与这些过程相关的蛋白质集群。到目前为止，双向凝胶电泳技术仍然以高分辨率、高灵敏度在蛋白质组学的研究中占据及其重要的地位。　　 脑组织是一个相互联系的复杂整体，各个脑区并不能够单独完成某一生物学功能。本实验针对脑功能的复杂性及整体性，选择了在意识状态中比较重要的海马、丘脑及额叶作为研究对象，从这些组织中提取磷酸化蛋白，通过双向电泳技术分离提取到的蛋白质来观察丙泊酚麻醉后蛋白的差异表达。进一步通过生物信息学分析，总结差异蛋白的亚细胞定位、主要功能及所参与的生物学过程，初步分析和整合麻醉后海马、丘脑及额叶功能的变化。　　 二、研究目的　　 利用蛋白质组学技术和生物信息学研究对照组及丙泊酚麻醉组大鼠海马、丘脑及额叶中差异磷酸化蛋白的表达，从整体水平探索磷酸化蛋白质的作用模式、功能调节以及在蛋白质群内的相互作用，以期对丙泊酚麻醉机制研究提供帮助。　　 三、材料和方法　　 1、20只雄性SD大鼠，体重180～220g，随机分为丙泊酚麻醉组（P组）和对照组（C组）。P组:经尾静脉泵入大鼠诱导剂量的丙泊酚10mg/kg，注药时间为1min，之后继续按照24mg/kg/h的速度泵入丙泊酚，时间共计20min。C组:按同样的速度泵入等体积的生理盐水，时间共计20min。　　 2、分别提取大鼠海马、丘脑及额叶的总蛋白，采用磷酸化蛋白富集试剂盒富集各脑区中的磷酸化蛋白，并分离纯化。利用双向凝胶电泳分离磷酸化蛋白质组样品，获得各脑区磷酸化蛋白双向凝胶电泳图谱，凝胶经银染显色后，PQuest分析软件进行比较分析，筛选出差异1.5倍以上的蛋白点。将差异点从胶中切出，进行胶内酶解，得到肽段混合物。应用基质辅助的激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)分析方法对差异点进行磷酸化蛋白鉴定。通过MASCOT搜索引擎并对照SwissProt数据库对蛋白质进行检测及数据分析。　　 3、从2-DE筛选出的差异磷酸化蛋白中挑选了keratin18、gelsolin和ApolipoproteinE三种蛋白，应用westernblot的方法进行验证。　　 4、运用Uniprot和NCBI数据库对鉴定出来的差异表达的磷酸化蛋白进行生物信息学分析，探讨其在体内的作用。　　 四、结果　　 1、采用双向凝胶电泳技术分离磷酸化蛋白质组样品，凝胶经染色后使用PDQuest软件进行比较分析，并经质谱鉴定共发现了16个差异表达的蛋白质。在丘脑组织中，有1个蛋白质下调，2个蛋白质上调;在海马组织中，有3个蛋白质下调，4个蛋白质上调;在额叶组织中，鉴定出来的6个蛋白质均下调。　　 2、应用MALDI-TOFMS技术对差异蛋白质点进行鉴定，使用Mascot数据库，共鉴定出包括keratin18、gelsolin及ApolipoproteinE等16种蛋白质。　　 3、应用western-blot的方法对keratin18、gelsolin和ApolipoproteinE三种蛋白进行验证，蛋白变化趋势与质谱鉴定结果一致。　　 4、生物信息学分析表明，大部分检定蛋白定位于细胞浆(12)、细胞核(5)、细胞骨架(6);主要具有结合(10)、催化(7)、抗氧化(4)、受Ca2+调节(5)及对乙醇起反应(5)等功能;参与代谢(10)、生物调节(7)、生长发育(3)以及刺激-反应过程(6)等生物学过程。　　 五、结论　　 本实验运用磷酸化蛋白富集、比较蛋白质组学和生物信息学技术，成功鉴定到了包括信号转导蛋白、细胞骨架蛋白、代谢相关蛋白等16种在丙泊酚麻醉后差异表达的磷酸化蛋白，这些实验结果将为进一步探索丙泊酚全麻机制提供参考。