【摘 要】
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本文通过克隆家蝇乙酰胆碱受体α2-like、α5-like、α6-like以及β3-like四个基因片段,大小分别为1649bp、2340bp、1473bp、1296bp,基因序列经过测序鉴定后,与NCBI登记的家蝇nAChR四个亚基Mdα2、Mdα5、Mdα6与Mdβ3序列同源性皆高达95%以上,证明成功克隆了家蝇nAChR亚基的CDS序列,而来自于大鼠nAChR基因β2亚基由人工基因合成,与N
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本文通过克隆家蝇乙酰胆碱受体α2-like、α5-like、α6-like以及β3-like四个基因片段,大小分别为1649bp、2340bp、1473bp、1296bp,基因序列经过测序鉴定后,与NCBI登记的家蝇nAChR四个亚基Mdα2、Mdα5、Mdα6与Mdβ3序列同源性皆高达95%以上,证明成功克隆了家蝇nAChR亚基的CDS序列,而来自于大鼠nAChR基因β2亚基由人工基因合成,与NCBI登记的序列匹配度高达100%。利用双酶切的方法将四个nAChR亚基构建至载体PGEM-T的T7启动位点,然后用c RNA转录试剂盒将载体上目的基因转录为c RNA,以α2/β3、α5/β3、α6/β3,α2/β2、α5/β2、α6/β2的亚型组合形式等浓度混合注射入非洲爪蟾卵母细胞进行外源表达。细胞培养3～5天后,6组nAChR基因共聚体亚型组合c RNA会将受体蛋白表达于卵母细胞膜表面,进而可以运用双电极电压钳仪进行验证克隆基因功能蛋白是否能被非洲爪蟾卵母细胞表达成功,研究发现在乙酰胆碱浓度梯度（5、10、20、40、80μmol/m L）刺激下,用双电极电压钳仪检测到α2/β2亚基共聚体亚型有功能表达电流,且电流与乙酰胆碱浓度存在正相关性,相关系数R~2为0.9207,激活中浓度EC50为83.51±4.08μmol/m L,而其余五组亚型共聚体在乙酰胆碱刺激下尚未检测到家蝇烟碱乙酰胆碱受体亚基与来自于自身β3亚基或者脊椎动物大鼠β2亚基共聚体在外源载体上有功能表达电流,说明家蝇乙酰胆碱受体基因的α5、α6亚基在外源表达载体系中,无法与自身β亚基共表达功能,也没能与哺乳动物β亚基表达出功能电流。而α2虽然不能与家蝇自身β3亚基体外共表达,但经测得α2/β2亚基共聚体有功能表达电流,说明其可以与哺乳动物大鼠β2亚基共表达。经乙酰胆碱刺激检测非洲爪蟾卵母细胞成功表达家蝇nAChR亚基功能后,用靶标药物杀虫单与烯啶虫胺分别刺激细胞,检测电流与浓度的剂量关系。已知成功表达α2/β2亚基的细胞EC50为83.51±4.08μmol/m L,据此配置含有80μmol/m L乙酰胆碱的记录液分别配置沙蚕毒素类的杀虫单和新烟碱类的烯啶虫胺的浓度梯度（8、4、2、1、0.5μmol/m L）溶液进行刺激α2/β2亚基共聚体功能表达细胞,发现在烯啶虫胺的刺激下,电流变化与浓度梯度显著相关,相关系数R~2为0.9507,EC50为8.825±3.98μmol/m L,初步证明烯啶虫胺药物靶标是家蝇烟碱乙酰胆碱受体α2亚基。
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