甲醇是一种高能量密度的有机碳一化合物,可利用煤炭、生物质、二氧化碳等原料生产,是生物制造的理想原料。自然界中存在多种可利用甲醇的天然甲基营养菌,研究者通过对其突变筛选和遗传改造,实现了转化甲醇合成一些化学品。同时,基于对天然甲基营养菌的理解,在平台菌株中重构甲醇利用途径,创建人工甲基营养菌进行甲醇生物转化成为研究热点。然而已报道的人工甲基营养菌普遍存在甲醇同化效率低、甲醇耐受性差和甲醇利用限制因素不清晰的问题。本研究结合蛋白质工程、组学分析、耐受性工程等技术,旨在发掘人工甲基营养菌中影响甲醇代谢的关键因素,提高甲醇的生物转化效率。本论文主要分为以下几部分:第一章绪论,首先简要介绍了甲醇的生产和作为生物制造原料的优势。其次,介绍了甲醇利用途径,以及研究者构建人工甲基营养菌的初步尝试。然后,概述了目前提高甲醇利用效率的多种策略,以及人工甲基营养菌转化甲醇生产燃料和化学品的研究进展。最后,分析了目前研究存在的问题,简介了本论文的主要内容。第二章,针对甲醇氧化速率慢、中间物甲醛毒性高等问题,设计构建了 Mdh（甲醇脱氢酶）、Hps（6-磷酸己酮糖合成酶）和Phi（6-磷酸己酮糖异构酶）的融合蛋白,通过拉近空间距离,提高甲醇生物转化效率。首先筛选了具有较高催化活性的Bacillus stearothermophilus DSM 2334 来源的 NAD+-Mdh 和 B.methanolicus MGA3来源的Hps和Phi,然后利用不同长度的柔性连接肽构建双功能和三功能融合蛋白。发现当Mdh与Hps或者Hps-phi融合时,其甲醇氧化活性提高了多至4.8倍,催化甲醇生成果糖-6-磷酸的速率提高了 30%。通过SEC、DLS和TEM分析发现蛋白融合使蛋白的聚体状态发生了改变,生成了较大的复合体,因而可能提高了其催化性能。本研究的开展为加快甲醇氧化提供了一个有效元件。第三章,为挖掘影响甲醇利用的关键靶点。对课题组前期构建的甲醇依赖型菌株的出发菌株与进化后的突变菌株进行了比较转录组分析。结果发现两株菌的糖酵解、戊糖磷酸途径、氨基酸合成和呼吸链等相关基因的转录水平存在差异。进一步通过实验验证,证实了在有氧甲醇代谢时,Corynebacterium glutamicum可利用硝酸盐作为额外电子受体,平衡甲醇氧化生成的过量还原力;证实了菌株共利用木糖和甲醇时,部分氨基酸的生物合成受到限制;发现菌株可激活有利于甲醛受体核酮糖-5-磷酸再生的景天庚酮糖二磷酸酶途径,促进甲醇利用。本研究发现与鉴定了影响甲醇利用的关键因素,这为进一步构建高效甲醇依赖型菌株提供了有效靶点。第四章,针对甲醇依赖型菌株甲醇耐受性较差的问题,在甲醇逐渐增加的条件下对MX-11继续进行适应性进化,并筛选获得可以耐受20 g/L甲醇、且菌株利用甲醇和木糖生长速率加快的几株突变株。最优突变株MX-14的甲醇与木糖共代谢比例为7.04:1,菌株生长的碳源主要是甲醇。之后,转录组比对分析,发现在高浓度甲醇下,MX-14的糖酵解途径相关基因转录水平下调,而氨基酸生物合成、氧化磷酸化以及部分TCA循环相关基因的转录水平显著上调。这些基因的表达调控,可能是MX-14在高甲醇浓度下生长加快的原因。然后,基于甲醇耐受突变株的全基因组测序及反向代谢工程研究,鉴定了 O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶基因Cgl0653G1256A和受甲醇诱导表达的膜结合蛋白编码基因cgl0833C1439T突变对菌株的甲醇耐受性至关重要。弱化或失活cgl0653和cgl0833可提高菌株的甲醇耐受性。一方面本研究发现的甲醇耐受机制有助于加深对菌株甲醇耐受性的认识,并为菌株耐受性改造提供理论基础,另一方面本研究获得的甲醇耐受菌株可以为构建高效甲醇利用菌株提供底盘。综上所述,本论文探索了融合蛋白在甲醇生物转化中的应用,解析了部分影响甲醇利用的限制因素、甲醇毒性和细胞耐受机制,获得了具有较高甲醇耐受性和甲醇利用效率的甲醇依赖型C.glutamicum。本论文的研究为改造人工甲基营养菌,提升甲醇生物转化效率奠定了基础。