自20世纪70年代起辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)是治疗不孕不育症的有效方法,全世界罹患不孕症夫妇的比例不断增加,通过辅助生殖技术出生的试管婴儿累计数量已达600万;经过40年的飞速发展,辅助生殖技术已经具有相当成熟的技术,主要包括体外受精(in vitro fertilization,IVF)、胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)、植入前遗传学诊断(pre-implantation genetic diagnosis/screening,PGD/PGS)以及胚胞移植术(germinal vesicle transfer,GVT)。辅助生殖技术稳定的妊娠率可以有效帮助不孕与不育夫妇解决生育问题,但其非生理性的体外操作过程,是否会对子代造成不良结局等安全性问题备受关注。妊娠期胎盘是母体与胎儿联系的重要器官,胎儿在母体子宫内的生长及发育依赖于胎盘的营养物质转运体将氨基酸等营养物质从母体转运给胎儿,ART是否影响胎盘特定营养物质的转运能力从而导致相关生长及发育问题目前尚无定论。我们通过研究ART是否影响胎儿的生长发育并分析胎盘中主要营养物质氨基酸的转运能力从而导致代谢性问题,进一步探索辅助生殖技术与子代长时程健康问题及表观遗传学问题的相关机制;为预防辅助生殖技术相关安全性问题提供更多的科学理论依据。第一部分:辅助生殖技术对小鼠胎盘氨基酸转运通道载体蛋白表达影响的研究目的:研究辅助生殖技术是否通过影响小鼠胎盘氨基酸转运通道载体蛋白从而影响胎鼠的生长发育。方法:(1)建立IVF小鼠模型,将妊娠18.5天(E18.5)IVF胎鼠和自然妊娠胎鼠作为研究对象,比较两组小鼠E18.5胎鼠体重、胎盘重量及胎盘效率;(2)选取E18.5IVF小鼠胎盘组织为实验组,E18.5自然妊娠小鼠胎盘组织为对照组,采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)方法检测两组胎盘组织中主要氨基酸转运体A系统中Slc38a1、Slc38a2、Slc38a4及L系统中Slc7a5、Slc7a8的mRNA表达水平;(3)采用蛋白质印迹(Western blot)方法检测两组胎盘组织中氨基酸转运体A系统中Snat1、Snat2、Snat4及L系统中Lat1、Lat2的蛋白表达水平;(4)采用免疫荧光染色技术检测两组胎盘组织中氨基酸转运体A系统中Snat1、Snat2、Snat4及L系统中Lat1、Lat2的蛋白组织学定位。结果:(1)实验组通过IVF出生的胎鼠体重与对照组自然妊娠出生的胎鼠体重比较差异无统计学意义(1609.14±128.23 vs.1640.20±148.13,P>0.05);IVF组小鼠胎盘重量显著高于对照组自然妊娠小鼠胎盘重量(192.86±28.87 vs.126.20±21.50,P<0.05);IVF组小鼠胎盘效率显著低于对照组小鼠胎盘效率(8.52±1.54 vs.13.38±2.73,P<0.05)。(2)qRT-PCR结果显示:与自然妊娠对照组相比,IVF组小鼠胎盘A系统氨基酸转运体Slc38a1、Slc38a2、Slc38a4 mRNA表达水平显著下调,L系统氨基酸转运体Slc7a8 mRNA表达显著下调,但L系统氨基酸转运体Slc7a5mRNA表达水平无统计学差异;(3)Western blot结果显示:与自然妊娠对照组相比,IVF组小鼠胎盘A系统氨基酸转运体Snat1、Snat2、Snat4蛋白表达水平显著下调,L系统氨基酸转运体Lat2蛋白表达水平显著下调;(4)免疫荧光结果显示:与自然妊娠对照组相比,IVF组小鼠胎盘A系统氨基酸转运体Snat1、Snat2、Snat4在胎盘组织中低表达,L系统氨基酸转运体Lat2在胎盘组织中低表达。结论:通过小鼠实验提示辅助生殖技术助孕可能通过改变氨基酸转运体相关基因的表达水平,从而影响妊娠末期氨基酸的转运能力,从而导致母体与胎儿交换的氨基酸减少,进而导致胎盘出现代偿性增大现象,已达到增加母体通过胎盘向胎儿运输足够营养物质的目标。第二部分:辅助生殖技术对人类胎盘和胎儿生长发育影响的研究目的:研究辅助生殖技术对胎盘和胎儿生长发育状态以及胎盘效率的影响。方法:收集我院产科2016年3月至2016年12月期间住院,不孕因素主因输卵管因素,通过ART助孕妊娠后足月单胎出生的ART子代和自然妊娠后足月单胎出生的子代作为研究对象,排除妊娠期并发症等情况后纳入45例ART病例和78例自然妊娠病例,回顾性分析比较两组新生儿出生体重、胎盘重量以及胎盘效率。结果:(1)基线资料显示:ART组产妇年龄与自然妊娠组产妇年龄比较差异具有统计学意义(32.20±4.47 vs.28.06±3.03,P<0.05);但是ART组与自然妊娠组的产妇体重指数、生产次数、分娩方式、新生儿性别比较均无统计学差异。(2)ART组新生儿出生体重与对照组自然妊娠新生儿出生体重比较差异无统计学意义(3478.21±359.41 vs.3445.36±284.15,P>0.05);ART组新生儿胎盘重量显著高于对照组新生儿胎盘重量(589.56±103.24 vs.531.29±50.76,P<0.05);ART组新生儿胎盘效率显著低于对照组新生儿胎盘效率(5.98±0.48 vs.6.37±0.75,P<0.05);(3)通过对产妇体重指数、年龄等相关因素进行校正后,实验组ART助孕妊娠新生儿出生体重与对照组自然妊娠新生儿出生体重比较差异无统计学意义;而ART组新生儿胎盘重量显著高于对照组新生儿胎盘重量;以及ART组新生儿胎盘效率显著低于对照组新生儿胎盘效率。结论:通过辅助生殖技术助孕可能影响胎儿的生长及发育,新生儿胎盘重量的显著增大以及胎盘效率的显著降低提示胎儿在妊娠末期通过胎盘的补偿性增大从而获取足够的营养物质,进而达到与自然妊娠无明显差异的新生儿出生体重。第三部分:辅助生殖技术对人类胎盘氨基酸转运通道表达影响的研究目的:研究辅助生殖技术是否通过影响胎盘转运通道载体蛋白的表达从而影响胎盘氨基酸的转运能力。方法:随机选择2016年3月至2016年12月我院产科不孕因素为输卵管因素通过IVF妊娠后足月单胎出生无相关并发症的IVF子代胎盘组织30例为实验组和自然妊娠后足月单胎出生无相关并发症的子代胎盘组织30例为对照组。采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)方法检测两组胎盘组织中主要氨基酸转运体A系统中Slc38a1、Slc38a2、Slc38a4及L系统中Slc7a5、Slc7a8的mRNA表达水平,采用蛋白质印迹(Western blot)方法检测两组胎盘组织中氨基酸转运体A系统中SNAT1、SNAT2、SNAT4及L系统中LAT2的蛋白表达水平;采用免疫荧光染色技术检测两组胎盘组织中氨基酸转运体A系统中SNAT1、SNAT2、SNAT4及L系统中LAT1、LAT2的蛋白组织学定位。结果:(1)IVF组新生儿出生体重与对照组自然妊娠新生儿出生体重比较差异无统计学意义(3456.33±372.82 vs.3436.00±279.77,P>0.05);IVF组新生儿胎盘重量显著高于对照组新生儿胎盘重量(585.67±106.73 vs.534.33±49.67,P<0.05);IVF组新生儿胎盘效率显著低于对照组新生儿胎盘效率(5.87±0.55 vs.6.29±0.63,P<0.05);(2)qRT-PCR结果显示:与自然妊娠对照组相比,IVF组胎盘A系统氨基酸转运体Slc38a1、Slc38a2、Slc38a4 mRNA表达水平显著下调,L系统氨基酸转运体Slc7a8mRNA表达水平显著下调,但L系统氨基酸转运体Slc7a5 mRNA表达水平无统计学差异;(3)Western blot结果显示:与自然妊娠对照组相比,IVF组胎盘A系统氨基酸转运体SNAT1、SNAT2、SNAT4蛋白表达水平显著下调,L系统氨基酸转运体LAT2蛋白表达水平显著下调;(4)免疫荧光结果显示:与自然妊娠对照组相比,IVF组人胎盘A系统氨基酸转运体SNAT1、SNAT2、SNAT4在胎盘组织中低表达,L系统氨基酸转运体LAT2在胎盘组织中低表达。结论:辅助生殖术可能通过改变氨基酸转运体相关基因的表达水平,从而影响妊娠末期氨基酸转运能力,进而导致母体与胎儿之间交换的氨基酸减少,以至于胎盘的代偿性增大满足胎儿妊娠末期营养物质需求,进而达到与自然妊娠无明显差异的出生体重;同时推测当母体通过胎盘运输至胎儿的营养物质不能满足胎儿妊娠末期的生长速度需求时,可能出现新生儿出生体重较低的现象。