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目的：用PCR方法结合DNA测序技术分析C-kit基因的突变类型，试图寻找新的突变位点；构建含突变的C-kit基因cDNA真核表达载体，将其转染人类胚胎肾细胞系，通过观察突变型C-kit基因对细胞增殖及细胞周期的影响，分析其功能状态；并通过观察稳定转染重组质粒人类胚胎肾细胞在裸鼠内的致瘤性来揭示其对人体细胞的恶性转化作用。 方法： 1 从8例经PCR-SSCP技术检测提示含C-kit基因突变的GIST标本中提取基因组DNA，用DNA测序技术筛选其中C-kit基因突变序列。 2 用RT-PCR技术从人胎脑组织克隆野生型C-kit基因cDNA。 3 根据所检测的测序结果，体外突变野生型C-kit cDNA，得到突变型C-kitcDNA；同时根据文献已报道的获得性功能C-kit基因突变序列，用体外突变方法得到相应的突变型C-kit cDNA，做为阳性对照。 4 将上述突变型和野生型C-kit基因cDNA片段构建于真核表达裁体pcDNA3质粒上。 5 将构建于pcDNA3的突变型C-kit cDNA和野生型C-kit cDNA(做为阴性对照)重组质粒及空白pcDNA3质粒通过脂质体法稳定转染HEK细胞。用Western blot方法检测C-kit蛋白的表达情况，观测转染细胞的生长曲线变化，用MTT法检测细胞增殖活性的变化，并用流式细胞仪检测C-kit基因突变体对细胞周期的影响。 6 观察稳定转染C-kit基因突变体的HEK细胞在裸鼠的致瘤性。 结果： 1 C-kit基因突变检测：8例GIST C-kit基因exon11测序结果显示3例含突变：1例为插入性突变，白密码子Codon 579插入12bp；1例为缺失性突变，Codon 557-559之间缺失6bp，致使密码子557和559缺失性突变；1例为两处点突变，Codon560由缬氨酸突变为天冬氨酸，Codon第二军医大学硕士论文 中文拍要 563由异亮氨酸突变为甲机酸。 2 使用逆转录技术从胎脑组织克隆出野生型 C－k i t基困 GDNA编码区，测 序结果显示所克隆的 cDNA片段和 Genbank收录的 C寸 i t基因 cDNA编码 区序列一致；用人工突变方法突变野生型 C寸 i t cDM，经测序证实突 变成功。 3 经顺切鉴定证实野生及突变型C寸it基因cD＊ A段已构建于p0M3 质粒。 4 稳定转染突变型 C－－k i t cDNA片段的 HEK细胞与转染野生型 C－k i t基因 及空白载体HEK细办比，细胞生长速度明显增快，细胞增殖活性明显 增强，细胞周期检测显示：转染C寸it基因突变体的实验组和阳性对照 组处于增殖期细胞（S硼一饲）比例明显高于转染野生型 C寸 i t cDM片 段阴性对照组和转染空白pCDNA3质粒载体的空白对照组，各组处于增 殖期的细胞比例依次为：48．34％（实验组）、48．24％（阳性对照组）、42．03 ％（阴性对照组人 42．16％（空白对照组）。 5 稳定转染质粒和PCDNA3KIT州W的HRK细触种于裸鼠背部可以成瘤， 而转染PCDNA3－KITW和空白PCDNA3 A体的朋K细胞则不成瘤。结论：14j1Ak中有 3例检测到 CAlt基因 exon门突变，其中 2例突变位点均位于文 洲民道的突变热点位置，提示中国人C寸it基因也可在该热点区域发生突 变；1例位于突变热点之外，提示 GI ST中 C十 i t基因突变部位不一，突变类 型复杂。2 以胎脑组织RNA为模板用RTPCR方法克隆出野生型C七上CDNA并以此为 模板用体外突变的方法获得CAn Codon579插入性突变及Codon559－560缺 失性突变相应的 cDNA，将上述三个卜kit cD回A亚克隆至pcDNA3后，用 BamHI 和 XhOI双酶切鉴定证实三个 C寸it ODNA片段已经成功构建于真核表达我体 PCDNA3，为C－kit基因功能研究打下基础。3 观察 C一 t基因突变体的 GDM对见K细跳殖活性和细胞周期的影响，结果 表明稳定转染C七it突变体与转染空白PGD＊3载体及转染野生型C寸it CDNA ’第二军医大学硕士论文 中文摘在 组的HEK细胞系相比细胞生长速度加快，增殖活性更强，处于增殖期的细胞 比例明显较高，说明本例 GI ST中的突变 C寸 i t基因为柳性功能突变，同 时提示C－kit基因突变可使人类细胞的增殖活性明显增强，并可以使更多的 细胞由既期以增殖期；而野生型C士it基因表达对细胞功能状态无明显 影响。4 用。estern blot免疫印迹方法检测质粒pcDNA3、pcDNA3－KITw、pcDNA3－ KIT皿、pcDM3KIT0W在邢K细胞的表达，结果显示转染 pc0M3质粒的 空白对照组未显示条带，而其余各组均有Ck i t蛋白表达，从而证实各重组 质粒已在HEK细胞中稳定转染并表达．5 将姊突变体重组质粒的 HEK细胞注射A＃鼠体内，诱导课鼠肿瘤生成获 得成功，说明本例C七it基因突变也可对细鹏较强的转化作用，提示C七it 基因突变有可能是引起 GI ST的恶性转化的关脱制之一。