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桑黄(Phellinus sp.),俗称桑黄菇、桑臣、桑耳等,是担子菌亚门层菌纲多孔菌目多孔菌科针层菌属的一种珍贵的药用真菌。子实体入药最佳,味微苦,能利五脏、排毒、活血等。文献报道,桑黄子实体具有抗肿瘤、增强免疫力、抗诱变功能、降血糖等活性。特别是桑黄的抗氧化活性引起人们的关注,本论文对不同品种、不同培养方式得到的桑黄原料中的抗氧化活性成分进行了筛选、分离、纯化及体外抗肿瘤和修复神经细胞的生物活性研究。本论文的研究结果对了解桑黄抗氧化的活性成分及开发相关产品有一定的理论参考价值。本论文分四个部分,主要研究结果如下:
1、比较不同品种桑黄子实体化学成分和生物活性的差异,筛选出抗氧化活性较高的品种
以具有抗氧化活性的多糖和黄酮为主要指标,通过比较八种桑黄子实体多糖和黄酮含量差异及生物活性的高低,选取优良品种进行活性物质的分离纯化研究。采用水提醇沉法提取了八种不同桑黄子实体的粗多糖,测定了八种桑黄粗多糖中多糖和蛋白质含量,分析了其单糖组成和氨基酸成分,同时对八种桑黄粗多糖清除活性氧自由基和刺激淋巴细胞增殖的活性进行来的检测。结果表明,八种桑黄水提醇沉物中多糖和蛋白质的含量有较大差异,单糖组成、氨基酸种类和含量也存在有一定的差异,其中PB-10的多糖得率(2.9％)和多糖含量(48.3％)较其他七种桑黄高,且PB-10粗多糖清除活性氧自由基能力也最高,其清除超氧阴离子、羟基、H2O2自由基的IC50值分别为0.45±0.13mg／mL,20.52±4.76μg／mL,16.47±1.53μg／mL。体外刺激小鼠脾淋巴细胞增殖的实验结果显示,PB-10和JSH粗多糖在50μg／ml浓度时淋巴细胞的增殖率为286.84％。
PB-10子实体70％乙醇提取物的体外抗氧化活性(超氧阴离子、羟基、H2O2自由基的清除)实验表明,其清除超氧阴离子、羟基自由基以及H2O2的IC50值分别为11.13±2.32μg／mL,、0.53±0.13μg／mL和1.38±0.97μg／mL,较桑黄粗多糖有更好的抗氧化活性。
2、比较了培养方式对桑黄化学成分及抗氧化活性的影响
通过比较同一桑黄菌株的发酵培养菌丝体和人工栽培子实体中的黄酮类物质含量及其抗氧化活性发现人工栽培桑黄子实体醇提物中黄酮的含量(52.42％)高于发酵菌丝体醇提物黄酮含量(16.74％)；其抗氧化活性(清除超氧阴离子、H2O2、DPPH的IC50值分别为34.65±8.91μg／ml、4.71±0.91ng／ml、8.18±1.14g／ml)能力均明显高于发酵菌丝体(清除超氧阴离子、H2O2、DPPH的IC50值分别为56.67±11.41μg／ml、7.65±0.49ng／ml、15.90±3.32g／ml)。对椴木栽培一年生、两年生桑黄子实体醇提物、水提物中黄酮、三萜、多糖含量及其抗氧化(还原力测定、H2O2和DPPH的清除)、体外细胞免疫活性进行了分析比较,结果表明,一年生桑黄子实体的黄酮、三萜和多糖的含量略高于两年生桑黄；抗氧化活性优于两年生桑黄。
3、桑黄子实体抗氧化活性成分的分离纯化及结构分析
采用四种不同极性的有机溶剂对桑黄乙醇提取液依次萃取得到石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和醇水相。对五种萃取相分别进行了清除NO自由基、超氧阴离子、羟基自由基、H2O2自由基、DPPH自由基,还原力测定以及抗脂质过氧化实验。实验结果表明,乙酸乙酯相在清除超氧阴离子、羟基、H2O2及DPPH自由基实验中的IC50值分别为2.98±0.01μg／ml、0.041±0.001μg／ml、0.24±0.07μg／ml、3.89±0.02μg／ml,高于其它萃取相；并且乙酸乙酯相还具有较强的还原力和抗脂质过氧化能力。研究发现五种萃取相的抗氧化活性与其黄酮含量有一定的相关性。
用硅胶、Sephadex LH-20和聚酰胺等对抗氧化活性较高的乙酸乙酯相继续进行分离纯化,经过柱层析和重结晶反复纯化,得到4个单一化合物:PB-EA-1、PB-EA-2、PB-EA-3、PB-EA-4。对纯化后的样品进行1HNMR,13CNMR,DEPT,1H-1HCOSY,HMQC等波谱分析并结合相关文献报道数据,鉴定出化合物PB-EA-3化学式为C25H18O9,其被命名为Inoscavin A
4、分离纯化组分的抗氧化、抑制肿瘤细胞生长和保护神经细胞的活性
对PB-EA-2、PB-EA-3、PB-nB三种样品进行抗氧化实验,并通过抑制肿瘤细胞生长和修复损伤神经细胞实验来观察有抗氧化活性组分的其他药理活性。研究表明,PB-EA-3较乙酸乙酯相的抗氧化活性有了提高,在10-50μg／mL时即可以有效地抑制肝癌细胞HepG2的生长,同时又不损伤正常肝细胞LO2。
PB-EA-3在100μg／mL时,能够使2.5mmol H2O2刺激4h损伤后的PC12细胞恢复到细胞原有存活数量,说明桑黄中存在抗氧化的活性成分。