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驱动蛋白是一类广泛分布于所有真核生物中的马达蛋白,可以直接利用水解ATP产生的能量沿着微管运动,进而参与许多重要的细胞生物学过程,比如,膜泡的转运、染色体的分离以及微管动态结构的调节等。本实验室成员从烟草胚胎的cDNA文库中筛选到了一个克隆,经生物信息学分析发现其具有驱动蛋白家族的典型结构特征：N端保守的motor domain,中间由3个coiled coil组成的stalk domain及羧基端的球形尾部domain,据此我们将其命名为NtKRP。表达模式分析显示,NtKRP主要分布在细胞分裂比较旺盛的部位,而NtKRP的RNAi株系出现了较野生型根尖分裂区长度变短及细胞数目变少的特征,并且胚大小及种子千粒重较野生型也明显小、轻。本人在此基础上,对NtKRP的生化活性及功能又做了具体的分析,期望可以揭示出NtKRP在烟草的生长及发育过程中到底起什么样的作用。具体实验结果如下：1. 通过Clustal X2生物信息学软件进行同源比对后,再经过MEGA5.0的进化树分析发现,NtKRP属于kinesin-12家族一新成员,与苜蓿中KIF15在进化上最为接近。2. 利用体外微管共沉淀实验证明了NtKRP具有ATP依赖的微管结合活性,又通过酵母双杂交的方法证明了NtKRP可以通过stalk domain的coiled coil结构形成二聚体,而微管依赖的ATPase活性已经被本实验成员所证明,至此我们可以得出这样的结论：NtKRP具有驱动蛋白所有的典型特征,是一个驱动蛋白家族新成员。3. 通过基因枪与瞬时转化小叶烟草的方法证明了NtKRP全蛋白,taildomain及motor domain的亚细胞定位分别为：NtKRP全蛋白与tail domain仅分布在细胞质中,而motor domain于细胞核和细胞质中都存在,因此说明了NtKRP全蛋白的亚细胞定位是由其tail domain决定的,而不是由Inotor domain决定的。4. 定量检测了41个NtKRP RNAi株系中NtKRP的表达情况,并从中选出了KC1-2和KF18-2两个下调最明显的株系,测量了该株系的种子与野生型的种子的截面积及千粒重,结果发现：RNAi株系的种子大小及千粒重较野生型的明显的小、轻。因此我们推测NtKRP在调节种子的发育过程中起了一定的作用。5. 根据上述NtKRP具有微管结合的特性及组织分布特性,再加J二RNAi株系呈现出根尖分生区细胞数目减少的表型,推测或许NtKRP在调节细胞分裂进程的过程中起了一定的作用。因此,我们对NtKRP启动子及全蛋白序列进行了分析,结果发现：NtKRP起始密码子ATG上游1260bp范围内存在有5个MSA序列,N端头部存在两个保守的CDKA;1的磷酸化位点,全序列上存在6个D型破坏框。这『F是M期特异驱动蛋白的典型特征。该结果提示,NtKRP很可能在M期参与调节细胞分裂。6. 因此我们通过酵母双杂交的方法,体外Gst pull down的方法以及BIFC的方法证明了NtKRP确实可以通过其上的磷酸化位点区域与CDKA;1直接相互作用,结果提示我们,很有可能是CDKA;1首先与NtKRP结合然后将其磷酸化后使NtKRP发挥其调节细胞分裂进程的功能。7. 如果NtKRP的确是一个可以调节细胞分裂进程的基因,则将其RNAi干涉后,细胞内一些其他保守的细胞分裂相关基因的表达一定会受到不同程度的影响,因此我们选择了14个烟草体内的细胞分裂相关的基因在NtKRP下调最明显的株系中进行了检测,结果显示：14个细胞分裂相关基因都出现了不同程度的下调,该结果进一步的证实了NtKRP是可以调节细胞分裂进程的基因。8. 意外的是,NtKRP的tail domain并没订发现有保守的CDKA;1的磷酸化位点,然而,通过酵母双杂交,体外Gst pull down以及BIFC |司时都证明了NtKRP的tail domain可以直接与CDKA;1相互作用,而驱动蛋白的尾部主要是与cargo结合后发挥作用的,该结果表明尾部序列上还存在有非保守的CDKA;1磷酸化的位点,NtKRP可以与CDKA;1结合后,并将其运输到特定的部位发挥作用。这是在kinesin-12家族中首次发现的除磷酸化位点外还存在另外CDKA结合位点的成员。9. 构建了转化效率为1×106个转化子/μg pGADT7Rec载体,滴度为9×108cfu/ml的烟草茎尖和幼叶的酵母双杂交cDNA文库。10. 以NtKRP的tail domain为诱饵蛋白对上述的文库进行筛选,最后得到了22个阳性克隆,其中包括组蛋白H2A, DNA结合及RNA加工相关的蛋白,核糖体蛋白,泛素融合蛋白、金属离子转运蛋白、叶绿体/线粒体相关蛋白等,提示NtKRP有可能参与细胞内多种生物学过程。11.由于酵母双杂交存在假阳性,因此筛选出的阳性克隆还需要其他的实验来证明其是否为真正的互作。根据基因是否有功能提示,是否是CDS全长或接近全长的原则,我们选择了9个克隆做后续的验证。同样我们通过两种手段：Gst pull down和BIFC进行了验证,结果显示,这9个克隆中只有两个蛋白在体外和体内都可以与NtKRP互作。本文将其标记为T16和K17。12.通过同源比对及进化树分析发现,T16和K17属于两个保守的60S核糖体大亚基的组成蛋白,前者为L44,后者为L17,因此将其分别命名为NtRPL441及NtRPL171。通过RT-PCR验证发现,NtRPL441及NtRPL171都是泛表达的基因,又通过基因枪和瞬时转化小叶烟草的方法证实了了他们定位在细胞核和细胞质中。13.通过RNAi干涉的方法研究NtRPL441及NtRPL171的功能。首先是通过real time PCR方法分别检测了NtRPL441及NtRPL171RNAi株系中基因表达情况,并且选出了下调最明显的株系,及下调相差两个循环的株系及没有下调的株系用于做后续的表型分析。14.由于NtKRP与NtRPL441/NtRPL171可以互作,因此我们在NtRPL441/ NtRPL171RNAi下调明显的株系中检测了NtKRP的表达情况,结果显不,NtKRP基因较野生型对照有明显的下调。由于前面我们已经证实了NtKRP是一个可以调节细胞分裂的基因,因此,NtRPL441及NtRPL171很可能也是两个与细胞分裂相关的基因。15.通过对NtRPL441及NtRPL171NRAi株系的表型分析发现,当将两基因RNAi干涉后出现了与NtKRP RNAi相似的表型,即胚根在萌发生长初期较野生型明显滞后,而随着时间的增加却与对照又没有明显的差异,这说明该基因主要在胚根的生长早期起作用,到了成苗后,RNAi株系的株高明显矮于对照,这表现在RN Ai株系的节间距要比对照的短,另外RNAi株系的叶子也出现了斑点现象,这些表型表明NtRPL441及NtRPL171通过影响NtKRP调节细胞分裂,在根尖和茎尖调控生长速度。16.同样,如果NtRPL441及NtRPL171的确是两个与细胞分裂有关的基因且处于同一调控途径中,则将其RNAi干涉后,细胞内一些其他保守的细胞分裂相关基因的表达也会受到不同程度的影响,因此我们选择了上述14个烟草体内的细胞分裂相关的基因其RNAi株系中进行了检测,结果是14个细胞分裂相关基因都出现了不同程度的下调,这一结果进一步的证实了NtRPL441及NtRPL171是两个调节细胞分裂进程的基因。通过与NtKRP互作调节细胞的分裂。