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骨肉瘤是常见的恶性程度极高的骨源性肿瘤,其发生、发展与机体免疫系统密切相关。恶性骨肿瘤病人通常伴有免疫抑制或损害,机体的免疫状态对骨肿瘤的发展、转归具有重要作用。随着保肢技术、综合化疗方案的应用及化疗剂量的增大骨肉瘤疗效有了显著的提高,但是,手术和化疗后易发生复发和耐药性。同时,化疗药除杀死肿瘤细胞外,对机体的免疫功能有较强的打击作用,从而严重影响疗效,甚至危及生命,因而提高骨肿瘤患者机体的免疫功能对于骨肿瘤的治疗显得十分重要。中医药在增强肿瘤患者机体免疫功能方面具有独特的作用,扶正培本法是医治疗恶性肿瘤的重要法则之一,尤其对机体免疫功能调节方面作用明显。本研究拟通过扶正培本中药加味六味地黄汤对恶性骨肿瘤化疗期间多项免疫指标的变化,分析恶性肿瘤病人的免疫状态,并研究其联合细胞因子诱导杀伤细胞（cytokines-induced killer,CIK）抗骨肉瘤细胞的作用,为骨肉瘤免疫治疗的有效证据。目的:1.评估骨肉瘤化疗前后外周血淋巴细胞多项免疫指标的变化;2.观察加味六味地黄汤对骨肉瘤化疗前后免疫调节作用;3.观察不同来源的CIK细胞及其与DC共培养后的扩增及表型情况,4.测定不同来源CIK细胞抗骨肉瘤细胞及骨肉瘤耐药细胞的作用;5.明确六味地黄汤含药血清对CIK细胞的诱导、增殖作用;6.测定六味地黄汤含药血清诱导扩增CIK细胞体外抗骨肉瘤作用。方法:1.采用流式细胞术检测104例骨肉瘤化疗病人的外周血T淋巴细胞抗原（CD3、CD4、CD8）,B淋巴细胞抗原（CD19、CD20）,NK细胞（CD16+56）等免疫指标变化;2.将104例骨肉瘤化疗患者分为中药治疗组、空白组、免疫治疗对照组,采用流式细胞仪检测治疗前后免疫指标的变化,以明确化疗对骨肉瘤患者免疫功能的影响及扶正固本法下组方加味六味地黄汤对骨肉瘤化疗患者的免疫调节作用;3.通过扩增来源于骨肉瘤患者和正常献血者的CIK细胞,使用来源骨肉瘤患者的肿瘤裂解物,负载DCs,以和CIK细胞共培养,经流式细胞仪检测扩增的CIK细胞增殖情况,和经51Cr细胞毒性分析检测扩增的CIK细胞细胞毒性活性;4.观察六味地黄汤含药血清对CIK细胞的增殖、细胞表型的作用,MTT显色法测定中药含药血清扩增CIK细胞体外抗骨肉瘤的毒活性。结果:1.骨肉瘤患者化疗后CD3+、CD4+、CD8+分子水平及CD4+/CD8+之比显著低于化治疗前（P＜0.01）,化疗使患者的Γ细胞数量明显减少,抑制性T细胞亚群显著性增多,骨肉瘤患者的细胞免疫功能显著性下降。骨肉瘤患者化疗前后CD19、CD20的水平比较有明显下降（P＜0.05或P＜0.01）,经T10方案化疗后,骨肉瘤患者的体液免疫也会受到抑制。2.经加味六味地黄汤治疗后,骨肉瘤患者的CD3+和CD8+的分子水平有显著性升高（P＜0.01）,而CD4+的分子水平及CD4+/CD8+之比有增高但不明显（P＞0.05）,中药能使骨肉瘤化疗患者T细胞及其亚群数量增多,但免疫的球蛋白的功能改善不明显,其有一定增强患者的免疫功能的作用。经中药干预后,患者的CD19、CD20的水平有了显著性升高（P＜0.05或P＜0.01）,说明中药不但可提高骨肉瘤患者的免疫细胞水平,还能提高患者体液免疫水平。3.患者化疗期间采用欣吉尔治疗后,CD4+、CD3+的分子水平有升高,但不明显（P＞0.05）,CD4+/CD8+的比值有显著性升高（P＜0.01）,说明欣粒生具有一定改善骨肉瘤患者免疫功能的作用。经欣吉尔干预后,患者的CD19、CD20的水平有一定升高,但前后比较无统计分意义（P＞0.05）,欣吉尔对患者体液免疫水平作用有限。4.患者和正常献血者均成功诱导出CIK细胞,正常献血者的CIK细胞增殖和细胞毒性都略高于骨肉瘤患者。随着效靶比增加,每组中CIK细胞的细胞毒性也逐渐增加,不管正常献血者还是患者,与肿瘤裂解物负载的DCs共培养的CIK细胞的增殖和细胞毒性明显高于单独培养的CIK细胞（P＜0.05）。全部细胞的CD3+CD56+共表达在整个培养过程均明显增加。而且CIK细胞对骨肉瘤耐药性细胞有着强大的细胞毒性。5.单纯含中药六味地黄汤血清难以诱导出CIK细胞;含中药六味地黄汤血清联合细胞因子培养的CIK增殖倍数明显要高于无药血清和无血清培养的（P＜0.05）,而含药血清中剂量的CIK增殖速度高于低和高剂量血清培养的;流式细胞仪检测各组培养的CIK细胞表型,发现含药血清低剂量（2%）对CIK细胞表达CD3+CD56+双阳性最好,明显高于其他各组培养的CIK细胞,其中单纯含药血清中剂量培养对CIK细胞表达CD3+CD56+无较大作用。含药血清低剂量（2%）联合细胞因子的CIK细胞对骨肉瘤细胞的抑瘤作用明显强于各组的CIK细胞（P＜0.05）。结论:1.化疗会引起骨肉瘤病人的免疫功能降低。2.加味六味地黄汤及欣吉尔（IL-2）可激活骨肉瘤患者T淋巴细胞,提高患者的免疫功能,加味六味地黄汤可提高骨肉瘤患者细胞及体液免疫功能,而欣吉尔主要提高骨肉瘤患者的细胞免疫功能,对体液免疫功能影响较小。3.CIK细胞的体外增殖力及对骨肉瘤细胞的杀伤活性与机体状态有关,CIK细胞对骨肉瘤细胞及骨肉瘤耐药细胞的杀伤活性存在量效及时效关系,CIK细胞与肿瘤裂解物负载的DCs共培养后,有着更强的细胞毒性活性。4.单纯的六味地黄汤无法诱导出正常的CIK细胞,中药六味地黄汤可促进CIK细胞增殖,尤以中剂量为佳,低剂量中药组联合细胞因子诱导的CIK细胞表型最为稳定,联合CIK细胞具有更强杀死骨肉瘤细胞的作用,CIK可有效应用于骨肉瘤临床的免疫治疗。