LRRK2蛋白Roc结构域突变体的生物化学及生物结构研究

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位于LRRK2蛋白基因序列上的突变会导致家族遗传性或散发性帕金森病。LRRK2蛋白具有GTP酶活性(GTPase)和激酶活性(kinase)。大多数关于帕金森病治疗手段的研究仍集中在对LRRK2蛋白激酶活性的抑制方面,对于LRRK2蛋白GTP酶活性研究比较少。目前已有的关于Roc结构域上致病突变R1441H/C/G的生化性质研究发现,LRRK2蛋白的Roc结构域单聚-二聚构象间的动态转换平衡对维持正常的GTP酶活性有着重要的作用。作为同样位于Roc结构域上的致病突变N1437H,我们想知道其是否会表现出同其它致病突变相类似的生化性质,进而深入理解LRRK2蛋白单聚-二聚构象动态平衡与内在GTP酶活性、GTP酶活性与激酶活性之间的潜在联系,对LRRK2蛋白的生物学功能以及帕金森病治疗手段的研究具有重要意义。本课题选取LRRK2蛋白的Roc结构域及其致病突变体RocN1437H进行生物化学、生物物理、酶动力学等实验。实验发现,与RocR1441H在溶液中主要以单聚构象存在的研究结果相反,RocN1437H在溶液中表现出了更加稳定的二聚构象;同RocWT相比,RocN1437H蛋白的GTP酶活性呈现3.5倍左右的降低;随后利用荧光偏振实验测定GTP结合能力,我们发现RocN1437H的GTP结合能力2倍弱于RocWT,此结果与RocR1441H增强GTP结合力的现象是完全相反的;在测定核苷酸GTP解离速率的实验结果中显示RocN1437H的GTP解离速率也明显低于RocWT,提示N1437H突变破坏了Roc蛋白核苷酸GDP/GTP交换的正常循环。上述研究结果表明,LRRK2蛋白单聚-二聚构象的动态平衡对于维持其正常的GTP酶活性是十分重要的;致病突变N1437H将Roc固定在二聚状态,破坏了LRRK2蛋白正常的单聚-二聚构象的动态转换平衡以及GDP-GTP交换反应,从而损害了LRRK2蛋白的GTP酶活性。此外,LRRK2蛋白的Roc结构域被报道存在帕金森病保护型突变R1398H。因此本课题研究了R1398H的相关生物化学、生物物理特性。发现同RocWT相比,RocR1398H在溶液中的构象、热稳定性、二级结构以及GTP结合能力等方面并无明显差异,GDP结合型R1398H蛋白晶体结构也显示与野生型并无明显差异,但RocR1398H的GTP酶活性相较于野生型Roc具有一定程度的降低,RocR1398H的GDP结合能力相较于RocWT却是相对升高的。该实验结果也进一步说明了LRRK2蛋白单聚-二聚构象的动态平衡对于其GTP酶活性的重要性。
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