研究背景急性胃肠炎是影响人群公共健康的重要疾病之一。经过去20多年的研究发现,病毒已经取代细菌成为引起急性胃肠炎最重要的病原体,其中最常见的是轮状病毒和诺如病毒。诺如病毒,又称为诺瓦克样病毒,是第一个被确认的能够引起急性胃肠炎的病毒。它可以感染任何年龄段的人群,而且由于其具有能够在宿主体外长时间稳定存活、引起感染只需要很低的病毒载量、感染后缺乏长期免疫以及基因组常发生变异、重组等特点,导致诺如病毒感染极易在散发基础上出现暴发流行,因此也被称为“胃肠流感”。虽然我国早在1995年就有了诺如病毒感染的病例报道,但由于缺乏快速、敏感的检测方法,而且未将诺如病毒感染列入医院常规检测项目,致使诺如病毒感染的分子流行病学特征和临床表现的相关资料不足,严重阻碍了诺如病毒感染的防治进展。轮状病毒被认为是引起儿童急性胃肠炎最重要的病原体,尤其是5岁以下年龄的儿童,在这一年龄段至少会经历过一次轮状病毒的感染。美国国家疾病预防与控制中心的报告指出,每年轮状病毒感染在全球范围内可以引起2500万患儿就诊,200万患儿住院治疗,将近60万患儿死亡,因此轮状病毒感染受到各国和地区的重视。但在临床治疗中发现并没有针对轮状感染的特效药物,从而将对轮状病毒感染的控制寄希望于高效价疫苗的研制与应用。诺如病毒是仅次于轮状病毒引起5岁以下儿童急性胃肠炎的常见病原体,虽然每年至多会引起20万患儿死亡而且引起的临床症状较轻,但由于一直没有研制出疫苗用来进行预防,因此诺如病毒的感染亦不容忽视。如果能在临床诊断与治疗中将二者感染进行鉴别,将会有效避免感染的大范围传播与流行。本研究主要分为两个部分：第一部分主要研究济南地区成人诺如病毒感染的分子流行病学特征与临床特征；第二部分主要研究济南地区5岁以下儿童轮状病毒与诺如病毒感染的分子流行病学特征以及二者感染特征的比较。旨在提供真实可靠的诺如病毒与轮状病毒感染的流行病学特征和临床表现资料,为疫苗的研制提供科学的依据,为疾病的防治提供帮助。第一部分济南成人急性胃肠炎患者诺如病毒感染的临床与分子流行病学特征研究目的：1.研究济南地区成人急性胃肠炎患者中诺如病毒的感染情况、流行特征及临床表现。2.研究济南地区成人诺如病毒感染患者中是否存在重组诺如病毒株。方法：1.自2010年6月至2011年5月,在山东大学齐鲁医院感染病科胃肠道门诊收集480例成人急性胃肠炎患者的临床资料及粪便标本。标本采集后立即混悬离心,提取上清液保存于-70℃直至用于提取病毒RNA。2.提取每例粪便标本中的病毒RNA,提取后立即用经灭活RNA酶处理的超纯水进行稀释,分装后保存于-700C待用。3.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法对提取的病毒RNA进行扩增。为检测是否存在变异重组诺如病毒株,每例病毒RNA标本均采用两种针对基因组不同编码序列区段的引物进行扩增。4.对扩增出来的核酸物质进行纯化,然后测定其序列。所有核酸序列应用BLAST程序同NCBI GenBank数据库中保存的诺如病毒株序列进行比对,然后采用Clustal X与MEGA程序进行多序列比对和构建进化树,进行流行基因型的分析。5.对具有变异重组可能的病毒株RNA进行跨区域核酸序列扩增,扩增后提纯并测序,然后应用Simplot软件进行重组分析。结果：1.在收集到的480例粪便标本中,42例被检测出诺如病毒阳性,阳性率为8.75%。2.检测到的诺如病毒株主要有7个基因型,GⅠ-1,GⅠ-4,GⅡ-1,GⅡ-3,GⅡ-4,GⅡ-6和GⅡ-13。其中最为流行的优势基因型为GⅡ-4(29/42,69.0%)。3.诺如病毒感染患者的临床表现主要为腹泻(97.6%)、腹痛(40.5%)、发热(28.6%)和呕吐(16.7%)。腹泻与呕吐的频次分别为6.08(±1.42)次/天和2.61(±1.37)次/天。4.诺如病毒感染全年均可见到,高峰期出现在9月至12月,低谷期出现在6月至7月。5.在42株诺如病毒中,发现3株重组型病毒,分别为2株GⅡ-4聚合酶/GⅡ-3衣壳重组株和1株GⅡ-6聚合酶/GⅡ-4衣壳重组株。结论：诺如病毒已经成为济南地区导致成人急性胃肠炎常见的病原体。感染常年可见,高峰期主要出现在9月至12月,引起的常见临床表现为腹泻、腹痛、发热和呕吐。流行的诺如病毒基因呈多样性,GⅡ-4为流行优势基因型,与全球的流行趋势相吻合。诺如病毒基因组易发生重组,在本研究中也出现了3株重组病毒株,其中GⅡ-6聚合酶/GⅡ-4衣壳重组株在中国还是第一次发现,应该给予重视并进行持续性观察,避免引起大范围的暴发流行。第二部分济南地区儿童轮状病毒与诺如病毒感染的临床与分子流行病学特征及两者特征比较的研究目的：1.研究济南地区5岁以下儿童急性胃肠炎患者中轮状病毒感染情况、流行特征及临床表现。2.研究济南地区5岁以下儿童急性胃肠炎患者中诺如病毒感染情况、流行特征及临床表现。3.研究济南地区5岁以下儿童诺如病毒感染与轮状病毒感染特征的比较。方法：1.自2011年2月至2012年1月在山东大学齐鲁医院儿科与山东大学齐鲁儿童医院收集767例5岁以下急性胃肠炎患儿的临床资料与粪便标本。其中门诊患者502例,住院患者265例。标本采集后立即混悬离心,提取上清液保存于-70℃直至用于提取病毒RNA。2.提取每例粪便标本中的病毒RNA,提取后立即用经灭活RNA酶处理的超纯水进行稀释,分装后保存于-70℃待用。3.采用ELISA的方法对每例粪便标本进行轮状病毒的初步筛查,对阳性标本的病毒RNA采用针对不同基因型和血清型的引物进行RT-PCR扩增。为避免ELISA假阴性结果的出现,从阴性标本中随机抽取252例(50%)同时进行扩增。4.扩增获得的轮状病毒核酸序列进行琼脂糖凝胶电泳,然后经溴化乙锭染色在紫外线下观察,鉴定不同基因型和血清型。5.采用不同基因组型诺如病毒扩增引物对所有粪便标本提取的病毒RNA进行核酸序列的扩增,然后提纯并进行测序。所有核酸序列应用BLAST程序同NCBI GenBank数据库中保存的诺如病毒株序列进行比对,然后采用Clustal X与MEGA程序构建进化树,进行流行基因型的分析。6.对收集到的患儿临床资料进行统计学分析,所有均数以±SD表示,组间比较采用卡方检验和U检验的方法,P<0.05代表具有统计学意义。结果：1.在收集到的767例粪便标本中,263例检测出轮状病毒阳性,阳性率为34.3%；80例检测出诺如病毒阳性,阳性率为10.4%。其中混合感染为8例。2.263例轮状病毒株中,检测出5种血清型和3种基因型,其中最常见的血清型和基因型分别为G3(40.7%)和P[8](46.8%)。3.80例诺如病毒株全部来自于GⅡ基因组,分别为GⅡ-3,GⅡ-4和GⅡ6。最为流行的基因型为GⅡ-4(61.2%),分别属于GⅡ-42004-2006和GⅡ-42006b两个亚型。4.轮状病毒感染患者与诺如病毒感染患者平均年龄分别为24.2(±14.0)个月和19.9(±15.8)个月。通过U检验两者之间的差别具有统计学意义。5.轮状病毒感染的高峰期出现在11月至次年的1月,诺如病毒感染的高峰期出现在9月至11月。6.轮状病毒和诺如病毒感染患儿的主要临床表现为腹泻、呕吐和发热。轮状病毒感染患儿的腹泻与呕吐平均频次分别为5.08(±1.85)次/天和2.61(±1.35)次／天,体温升高平均程度为38.0(4±0.65)。C；诺如病毒感染患儿的腹泻与呕吐平均频次分别为4.99(±±1.55)次/天和2.20(±1.47)次/天,体温升高平均程度为37.8(±0.62)。C。通过U检验发现腹泻频率、呕吐频率和发热程度之间的差异均不具有统计学的意义(P>0.05)。结论：轮状病毒与诺如病毒是济南地区引起5岁以下儿童急性胃肠炎的常见病原体,最为流行的基因型分别为G3P[8]和GⅡ-4。轮状病毒发病率明显要高于诺如病毒的发病率,而且在临床症状上表现的更为严重。感染常见于2岁以内的患儿,诺如病毒感染的患儿较轮状病毒感染的患儿要小几个月。最常见的症状是腹泻、呕吐和发热。感染在一年中均可见,但高峰期主要出现在秋冬季节,而且诺如病毒感染的高峰期比轮状病毒来的稍早。本研究展示了真实可靠的5岁以下儿童轮状病毒与诺如病毒感染的流行病学和临床表现特征,为病毒感染的预防、控制与治疗提供科学的依据。