Bacillus cereus B-02对Botrytis cinerea抑菌活性及拮抗机制的研究

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采用平板培养法和琼脂孔扩散法检测蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)B-02的抑菌活性,观察到B-02菌株及其代谢产物对灰霉病致病菌灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)均有明显的、不同程度的抑菌作用,其中,不同稀释浓度Ba.cereus B-02过滤液对Bo.cinerea菌丝生长有明显的抑制作用,并且起主要抑菌作用。在24~48h内B-02可以通过生防菌代谢产物在培养基中的扩散而对靶标真菌形成一定宽度的抑菌带。抑菌带旁的菌丝均不能正常向四周生长,导致菌丝在菌落中央堆积,颜色加深,呈灰褐色或黑褐色。鉴于Ba.cereus B-02胞外物质对病原真菌起主要抑菌作用,因而尝试用分离大分子蛋白质类物质常用的方法——(NH42SO4沉淀法和乙醇沉淀法来提取抑菌活性成分,得到的沉淀部分均无抑菌活性,观察到抑菌活性成分仍存在于上清液中。菌株发酵液在121℃高温灭菌30min后对病原菌仍具有较强的抑菌作用,说明B-02抑菌活性成分具有良好的热稳定性。为研究培养条件对Ba.cereus B-02菌株生长和抑菌活性的影响,分别采用分光光度计法、琼脂孔扩散法和杯碟法测定了B-02菌株的菌体量和抑菌活性。系统研究了B-02在不同液体培养基中的生长曲线、pH值和抑菌活性的变化,表明NB培养基较适合于液体摇培,其菌量达到高峰的时期是16h之后且抑菌带宽度达到5mm。同时,B-02菌株在装液量50ml/250ml和接种量1%(0.5ml/50ml)、摇床转速140r/min,32℃,初始pH9.0的NB培养液中振荡培养36h,其代谢产物的抑菌活性作用最为明显,较初始培养条件增加了16.2%。借助光学显微镜、扫描电子显微镜、透射电子显微镜和激光扫描共聚焦显微镜,从细胞形态学和生理学水平上研究Ba.cereus B-02过滤液对Bo.cinerea的拮抗机理。结果表明,B-02的代谢物质能够明显抑制病菌孢子萌发,一定浓度下可以使菌丝畸形,细胞崩解,内含物外泄,最终导致病菌丧失繁殖能力。处理菌丝表面形态受到严重破坏,发生强烈变形;菌丝细胞核、线粒体和细胞壁等亚细胞结构发生了明显改变,细胞内出现大量无膜透明内含物,并产生较大液泡。此外,处理菌丝DNA、线粒体膜电位和活性氧荧光强度均低于对照组,且差异极显著;说明B-02菌株对病原菌菌丝细胞DNA的合成、线粒体膜电位和活性氧水平有重要影响。
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