【摘 要】
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谷胱甘肽（Glutathione）是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的非蛋白类三肽化合物,广泛存在于大多数真核生物和某些原核生物中,在生物体内以还原型（GSH）占据了绝大部分。由于具有抗氧化性、清除自由基、解毒、美白等功能,谷胱甘肽被广泛应用于食品、医药和化妆品等行业。因此,近年来国内外对谷胱甘肽的需求呈现出一种上升趋势。本研究采用毕赤酵母发酵法制备谷胱甘肽,首先利用ARTP诱变结合梯度平板筛选
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谷胱甘肽（Glutathione）是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的非蛋白类三肽化合物,广泛存在于大多数真核生物和某些原核生物中,在生物体内以还原型（GSH）占据了绝大部分。由于具有抗氧化性、清除自由基、解毒、美白等功能,谷胱甘肽被广泛应用于食品、医药和化妆品等行业。因此,近年来国内外对谷胱甘肽的需求呈现出一种上升趋势。本研究采用毕赤酵母发酵法制备谷胱甘肽,首先利用ARTP诱变结合梯度平板筛选方法对出发菌株BY-1进行诱变处理,然后通过MMC适应性进化进一步提高筛选效率,获得高产菌株BY-2-24;进一步利用响应面分析法对发酵培养基进行优化,成功提高了谷胱甘肽摇瓶产量;最后通过1.5 L四联发酵罐培养,进一步优化发酵工艺。得到研究内容和结果如下:（1）谷胱甘肽高产菌株的诱变选育及适应性进化。采用常压室温等离子体诱变技术对毕赤酵母BY-1进行诱变,并利用微生物微液滴培养仪对经过梯度平板筛选获得的突变菌株进行MMC适应性进化。结果表明:出发菌株经过ARTP诱变处理、1,2,4-三氮唑梯度平板初筛、MMC适应性进化、摇瓶验证等,可以选育出高产谷胱甘肽的突变株。最终获得的菌株BY-2-24,其谷胱甘肽摇瓶产量达到312.1 mg/L,是出发菌株的2.34倍,且经过7次传代培养,仍然具有较好的遗传稳定性。（2）毕赤酵母产谷胱甘肽的发酵培养基优化。首先设计PB实验对影响谷胱甘肽发酵过程的显著因素进行筛选,然后利用BBD实验对显著因子进行优化最终确定了发酵培养基的最佳配比。结果表明:酵母提取物、无水磷酸二氢钾和七水硫酸镁对谷胱甘肽的发酵过程影响最显著。通过响应面分析最终获得了最适谷胱甘肽发酵的培养基配方:葡萄糖30 g/L,酵母提取物26 g/L,硫酸铵7.5 g/L,无水磷酸二氢钾2.6 g/L,七水硫酸镁0.3 g/L,氯化钠4.5 g/L,氯化钙1.5 g/L,半胱氨酸0.75 g/L。在此条件下,BY-2-24菌株的谷胱甘肽摇瓶产量为418.3 mg/L,相比优化前的产量（312.1 mg/L）有了大幅提升。（3）高产菌株在发酵罐上的发酵初探。对谷胱甘肽高产菌株BY-2-24进行1.5 L四联发酵罐培养,同时检测不同时间内的菌体浓度、p H值、残糖量、氨基氮和谷胱甘肽产量。结果表明:在谷胱甘肽分批发酵过程中,当初糖浓度为25 g/L、DO控制在35%时最有利于毕赤酵母生长,谷胱甘肽产量最高可达429.9 mg/L。最后通过流加葡萄糖的方式进一步提高了谷胱甘肽的罐上发酵水平,发酵48 h后,谷胱甘肽的产量达到436.3 mg/L。
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