【摘 要】
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黄龙病是造成柑橘减产的重大病害之一,严重影响着柑橘产业的未来,现在还没有有效的防控办法。为探究拮抗菌对柑橘黄龙病的防控效果,本研究进行了拮抗菌的分离、鉴定,研究其最佳发酵条件,并通过PCR克隆测序对其含有的抗生素合成基因进行了扩增验证,通过盆栽试验研究了其对柑橘黄龙病的促生效果与抗病机理,主要内容和结果如下:1.开展了菌株的分离纯化,经结晶紫染色在显微镜油镜下观察,菌体呈椭圆形,短杆状,且革兰氏染
【基金项目】
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国家自然科学基金项目(31572099、31872064); 国家重大科技研发计划(2018YFD0201500)
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黄龙病是造成柑橘减产的重大病害之一,严重影响着柑橘产业的未来,现在还没有有效的防控办法。为探究拮抗菌对柑橘黄龙病的防控效果,本研究进行了拮抗菌的分离、鉴定,研究其最佳发酵条件,并通过PCR克隆测序对其含有的抗生素合成基因进行了扩增验证,通过盆栽试验研究了其对柑橘黄龙病的促生效果与抗病机理,主要内容和结果如下:1.开展了菌株的分离纯化,经结晶紫染色在显微镜油镜下观察,菌体呈椭圆形,短杆状,且革兰氏染色为阳性。通过扫描电镜观察,菌体呈椭圆短杆状,长1.3~2.5μm,宽0.4~0.6μm,有二分裂的状态。再结合生理生化特性说明菌株1号符合芽孢杆菌属的特性。对菌株1号进行16Sr DNA、Rec A、Rec N三个基因扩增和序列鉴定,分析得出菌株1号与芽孢杆菌属标准菌株同源相似性均接近99%,进行多序列比对并构建系统发育树,得出菌株1号与Bacillus velezensis亲缘关系最近,结合菌落的形态特征观察和生理生化试验,鉴定1号菌株为贝莱斯芽孢杆菌。最后通过PCR扩增,显示菌株1号含有11种抗菌物质的基因片段,说明菌株1号有产生多种抗菌物质的可能性,选择其中三大家族表面活性素、伊枯草菌素和泛革素的srf AA、srf AD、itu3、fen E 4个抗生素基因克隆测序,分析结果均与Bacillus velezensis同源性达到99%,说明菌株1号可产生与抗病相关的重要次生代谢产物。2.通过对菌株1号生长曲线的测定,结合不同碳源、氮源、无机盐的单因素优化试验,得到最佳培养基组合:蔗糖0.3%,蛋白胨0.1%,氯化钠0.1%,蒸馏水1 L。在培养条件的试验中,对不同影响因素进行筛选,结果显示:培养16 h,温度37℃,摇床转速180 r/min,装液量为60/200 m L下菌株1号生长量最高。因此选择优化的培养基和培养条件,可有效的促进菌株1号生长量的增加和增强其产生次生代谢物的能力,从而提高菌株1号对黄龙病病原的抑制效果。3.对生理生化指标:总淀粉、可溶性糖、叶绿素含量及光合速率测定并进行显著性分析,结果表明:菌株1号的处理组和对照组差异显著。其中叶绿素含量、光合速率的处理组数据均比对照组高,淀粉、可溶性糖含量的处理组数据均比对照组低,说明菌株1号处理有利于减少感病植株体内可溶性糖和淀粉的积累并且提高了叶绿素含量和光合效率等生理指标。对多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、硫氧还蛋白还原酶(Trx R)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)进行酶活测定,得出菌株1号的处理组与对照组差异显著,说明菌株1号促进了与柑橘自身抗病相关的酶类,能够激起柑橘对外界不良环境的抵抗,提高了柑橘对黄龙病的拮抗能力。4.采用菌株1号灌根处理柑橘苗木,通过详细的试验方案对菌株1号的病原浓度进行验证,用q PCR和常规PCR的技术对黄龙病病原进行检测综合分析,得出结论:在第15次q PCR检测显示叶片和枝皮平均阴性率分别为40%和47%,相对表达量降低的分别为80%和87%,在第30次q PCR检测显示叶片和枝皮平均阴性率分别为60%和47%,相对表达量降低的分别为93%和80%。分析数据与对照相比,菌株1号有效地降低了柑橘黄龙病病菌的相对表达量,阳性苗木经菌株1号处理后,检测为阴性的苗木数量显著增加。说明菌株1号能有效地降低柑橘黄龙病病原浓度。
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