猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）,是由猪繁殖与综合征病毒引起的,能够导致妊娠母猪流产、仔猪呼吸道症状,且高死亡率的一种病毒性传染病,俗称蓝耳病。自该病被发现以来人们意识到其临床症状在个体间具有很大的差异性,PRRSV不产生特殊的临床症状,其表现的临床症状反映的是PRRSV的毒力,猪的年龄、免疫状态以及并发感染的存在。总体而言,PRRSV感染最常见的临床症状包括厌食、发热、嗜睡与呼吸系统疾病。在繁殖群中,临床症状可能包括不孕、流产、早产、死产、虚弱的猪数量增加以及新生仔猪急性腹泻。本病最早于1987年发现于美国中西部,我国于1991年首先出现在台湾地区,1996年在大陆暴发并蔓延流行。PRRSV感染引起机体的免疫抑制导致猪群其他疫苗的免疫失败及混合感染频发。近年来,由于PRRSV基因的易变异性以及PRRSV NADC30-like/NADC34-like等新流行毒株的出现,导致PRRSV在临床上的流行更加复杂。GP5蛋白由ORF5编码而成,是PRRSV的主要结构蛋白。同其它结构、非结构蛋白相比,GP5具有良好的免疫原性,主要体现在GP5诱导产生的抗体对PRRSV产生的中和效应最为相关。有研究表明,GP5蛋白存在两个B细胞抗原表位,其中产生中和性抗体的是位于下游的抗原表位,而处于上游的则属于诱饵表位,据推测,上游的诱饵表位在PRRSV感染初期产生大量的非中和性抗体,抑制下游B细胞中和表位诱导机体产生中和抗体,导致PRRSV逃避机体的体液免疫应答反应。目前有研究证实PRRSV依靠其囊膜蛋白的糖基化修饰来逃避宿主免疫反应,而去除PRRSV GP5中和表位临近的N-糖基化修饰可使病毒更易被抗体中和,且携带GP5糖基化缺失的突变病毒比野生型病毒引起更强的中和抗体反应,据此推测GP5蛋白中和表位周围的糖基化形成了聚糖屏蔽作用,促进了PRRSV的免疫逃逸。本研究利用Overlap PCR对PRRSV流行毒株毒株NADC30-like CHsx1401及经典毒株VR2332的GP5蛋白N35、N51位点分别进行定点突变,突变方向为碱性氨基酸精氨酸R（AGA）,将突变体连接到真核表达载体p CAGGS-EGFP上,构建重组表达载体:p CAGGS-CHsx1401-ORF5,p CAGGS-VR2332-ORF5,p CAGGS-CHsx1401-N35-AGA,p CA GGS-VR2332-N35-AGA,p CAGGS-CHsx1401-N51-AGA,p CAGGS-VR2332-N51-AGA,为排除糖基化可能受突变氨基酸酸碱性的影响,在制备上述重组质粒的基础上,另制备N35、N51位点的酸性氨基酸突变载体,突变方向为酸性氨基酸天冬氨酸D,p CAGGS-CHsx1401-N35-GAC,p CAGGS-VR2332-N35-GAC,p CAGGS-CHsx1401-N51-GAC,p CAGGS-VR2332-N51-GAC。通过脂质体转染法将相应真核表达质粒转染至293T细胞,以Western blot鉴定GP5蛋白在细胞中表达,对p CAGGS-CHsx1401-ORF5、p CAGGS-VR2332-ORF5表达蛋白使用两种内切糖苷酶处理,未处理的两毒株GP5蛋白条带均位于50KDa及以上,处理后,条带均下移至50KDa及以下,证明条带均存在N-糖基化修饰,推测上方条带为高水平糖基化GP5蛋白,下方条带为低水平糖基化GP5蛋白。为研究N35、N51位点突变对GP5糖基化水平的影响,将对相应重组真核表达质粒产生蛋白进行Western blot鉴定,试验结果表明,N35、N51氨基酸进行酸、碱性突变后,在高水平糖基化条带与低水平糖基条带之间出现一条新的蛋白条带,推测N35、N51位点的突变改变了GP5蛋白的结构形态。对各条带进行灰度值分析,统计学比较显示N35位突变体（p CAGGS-CHsx1401-N35-AGA、p CAGGS-VR2332-N35-AGA）在转染293T细胞表达后,表达的GP5蛋白总量均略高于原始未突变组,但无显著性差异;而N51位突变体（p CAGGS-CHsx1401-N51-AGA、p CAGGS-VR2332-N51-AGA）表达的GP5蛋白总量相较于原始未突变组显著降低。对各组蛋白印迹的高水平糖基化GP5比较显示:两种毒株的N35、N51 GP5突变体表达的高水平糖基化蛋白的量显著或极显著低于原始未突变组,说明糖基化位点的突变显著降低了高水平糖基化GP5的表达水平。在对各组蛋白印迹的低水平糖基化GP5的比较中显示:两种毒株的N51 GP5突变体表达的低水平糖基化蛋白的量显著或极显著低于原始未突变组。而N35 GP5突变体表达的低水平糖基化蛋白的量较原始未突变组不表现差异性,结合N35突变体表达的GP5蛋白总量较原始未突变组不表现显著性差异、表达的高水平糖基化蛋白的极显著低于原始p CAGGS-ORF5。我们推测,N35突变体表达的中糖基化水平蛋白,是由高糖基化水平蛋白去糖基化,向下迁移所致。有研究证明糖基化会覆盖抗原表位包括中和表位。而两毒株N35位点的突变体在蛋白总表达量无显著差异的基础上,其高水平糖基化GP5的表达显著降低了,故将PRRSV流行毒株NADC30-like及经典毒株VR2332原始GP5与N35突变体制备为核酸疫苗,并按照设定免疫程序免疫家兔,定期采集血清,测定其免疫表达反应,评估其免疫效果。结果在第14、28天,N35位点突变的核酸疫苗组免疫的家兔血清中的中和抗体与原始GP5组相比显著升高,其中p CAGGS-VR2332-N35-AGA组在第28d差异极显著。表明N35位点突变重组核酸疫苗能够激发机体产生更强的体液免疫。本研究通过内切糖苷酶酶解、氨基酸位点突变、制备核酸疫苗等方法,从以上结果可以初步得出结论,突变PRRSV GP5 N35、N51的单个糖基化位点显著改变了GP5蛋白的糖基化水平、高水平糖基化蛋白及低水平糖基化蛋白的表达量;其中N35位点突变体也诱导产生了显著提高的中和抗体,推测该突变改变了糖基对中和表位遮蔽。本研究为深入研究PRRSV结构蛋白的糖基化水平及其功能积累了数据,为新型PRRS疫苗的研发提供了思路。