【摘 要】
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背景:代谢重编程是癌细胞生存的能量基础,靶向肿瘤活跃的代谢途径可以诱导代谢创伤,影响肿瘤细胞的增殖能力、基因组稳定性,是目前肿瘤防治的热点问题。尿素循环与细胞内多胺代谢、嘧啶代谢、三羧酸循环等多个代谢通路相通,多个关键酶在黑色瘤细胞中发生明显调变,成为肿瘤在癌基因突变后适应性生长的重要代谢支持。尿素通道蛋白B（urea transporter B,UT-B）是尿素跨膜转运的重要膜通道蛋白,前期研究
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背景:代谢重编程是癌细胞生存的能量基础,靶向肿瘤活跃的代谢途径可以诱导代谢创伤,影响肿瘤细胞的增殖能力、基因组稳定性,是目前肿瘤防治的热点问题。尿素循环与细胞内多胺代谢、嘧啶代谢、三羧酸循环等多个代谢通路相通,多个关键酶在黑色瘤细胞中发生明显调变,成为肿瘤在癌基因突变后适应性生长的重要代谢支持。尿素通道蛋白B（urea transporter B,UT-B）是尿素跨膜转运的重要膜通道蛋白,前期研究发现过表达UT-B可明显改变黑色素瘤B16细胞的尿素循环和多胺代谢流量,提示UT-B基因表达下调也是黑色素瘤细胞代谢重编程的重要组成部分。转录组测序发现嘧啶代谢、DNA复制、细胞周期等多个通路基因调变明显,目前尚无UT-B与黑色素瘤细胞DAN损伤、DNA复制应激之间研究报道。因此本项目聚焦于代谢重编程与基因组稳定性调控热点问题,探讨UTB表达调变通过对黑色素瘤细胞的细胞周期和DNA复制应激影响,发挥抑癌作用的机制,阐明UT-B在肿瘤生物学功能中的作用,挖掘其作为黑色素瘤诊断生物标志物和潜在治疗靶点的可能性。目的:瞬时转染UT-B表达质粒增加UT-B表达水平后,观察黑色素瘤B16细胞增殖能力、细胞周期及DNA复制应激相关基因等的改变,探讨过表达UT-B是否通过细胞周期调控及代谢重构,诱导黑色素瘤细胞发生DNA复制应激发挥抑癌作用。方法:1、MTT实验观察细胞生长活力、计算细胞生存率;2、PI染色后,流式细胞术检测细胞周期;Annexin V染色后,应用流式观察细胞凋亡;3、转录组基因测序分析转染UT-B表达质粒后基因表达的差异变化,应用GO、KEGG进行基因富集分析,寻找调变明显的基因和信号通路;4、定量q-PCR检测UT-B的mRNA水平观察转染效率、验证转录组测序改变明显基因的mRNA水平、分析细胞周期和DNA复制应激相关基因的mRNA水平;5、Ed U染色后荧光显微镜分析DNA复制合成情况;6、DAPI染色后荧光显微镜观察细胞核的形态学改变;7、Western Blot检测DNA损伤分子H2AX的表达水平。结果:1、转染UT-B表达质粒后,UT-B的mRNA水平增加近3倍,48小时后可以明显抑制B16细胞生长,细胞发生G1期阻滞,凋亡水平明显增加。2、转录组测序结果显示:UT-B过表达的B16细胞与对照组比较上调的差异基因有1014个,下调基因657个。GO功能富集分析和KEGG途径富集分析后,发现差异表达的mRNA中以细胞周期、DNA复制、核糖体、嘧啶合成等细胞过程的相关基因调变明显。3、应用qPCR对转录组结果进行验证,发现UT-B过表达后参与组装DNA解旋酶、调控复制起点的MCM5基因,参与d NTP从头形成的核糖核苷酸还原酶RRM1基因表达明显下调,提示DNA复制受影响;参与嘧啶合成的胸苷酸合酶TYMS的表达水平也下调至仅为对照组的1/4,而尿素循环中关键酶CPS1表达上调,提示细胞内的N流量可能主要进入尿素循环,而影响了嘧啶代谢。4.WB检测了发现UT-B过表达后DNA损伤和复制应激标志物H2AX的表达水平明显上调,并且Ed U染色发现S期进行的DNA复制也明显减少,结合基因改变进一步明确发生了DNA复制应激。5、qPCR发现过表达UT-B后,参与DDR过程修复损伤DNA重要调变蛋白的Chek1、Chek2、ATR、CCNE2等基因水平的表达水平也明显下调,并有随时间增加趋势,提示细胞的DNA修复功能受损;应用DAPI染色发现部分细胞核膜完整性被破坏,有微核、葡萄核细胞存在,说明细胞发生了染色体灾难;6、观察了转染UT-B后B16细胞对DDP的敏感性,发现在与25μM的DDP合用,即可达到50μM的DDP治疗效果,发生合成致死。结论:1、过表达UT-B后,黑色素瘤B16细胞的DNA合成复制相关基因表达下调,DNA损伤和DNA复制应激标志物H2AX表达增加,Ed U标记的DNA复制减少,提示细胞发生DNA复制应激;2、过表达UT-B后,黑色素瘤B16细胞发生G1期阻滞,可能影响DNA复制叉的形成;而嘧啶代谢相关基因表达下调,可能导致DNA合成原料不足;3、过表达UT-B后,黑色素瘤B16细胞对损伤的DNA修复相关S-G2期调控点基因表达下调,细胞发生有丝分裂灾难,并可与DDP发生合成致死效果,为靶向代谢重编程的癌症治疗提供新的实验基础。
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