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禽致病性大肠杆菌（Avianpathogenic Escerichia coli,APEC）是肠道外致病性大肠杆菌（Extrainestinal pathogenic Escherichia coli,ExPEC）的主要成员之一,能够引起禽类心肌炎、败血症和脑膜炎等疾病,近年来,研究发现APEC具有人兽共患的潜力,严重威胁畜禽养殖业和人类健康的发展。大肠杆菌脑膜炎主要由菌血症或者败血症引起,具有高死亡率,存活者具有严重的神经系统损伤后遗症等特点。细菌性感染能够干扰宿主肠道菌群,破坏肠道屏障,而健康的肠道微生物区系能够缓解细菌引起的败血症及脑膜炎疾病。褪黑素具有多种生物学功能,包括抗炎症、抗氧化、抗凋亡以及改善肠道菌群来预防或治疗疾病的发生发展。目前,褪黑素在细菌性脑膜炎中的应用是作为辅助治疗药剂,而在预防细菌性脑膜炎发病及其相关机制方面未见报道。禽致脑膜炎大肠杆菌APECTW-XM从患有败血症/脑膜炎雏鸭的脑组织中分离得到,能够感染断奶小鼠和雏鸡而引起严重的急性败血症和脑膜炎,威胁禽类健康和养禽业发展。本研究旨在探究褪黑素在预防禽致脑膜炎大肠杆菌对小鼠的感染的保护作用,并从肠道菌群的角度深入探究褪黑素对大肠杆菌脑膜炎小鼠的预防机制。具体研究内容如下:1.褪黑素对APEC TW-XM感染诱导的小鼠脑膜炎的影响。本研究以大肠杆菌脑膜炎小鼠模型为基础,通过腹腔注射的方法补充不同浓度褪黑素（10 mg/kg,30 mg/kg 和 60 mg/kg）,处理1周后,腹腔注射 APEC TW-XM（1×107 cfu/只）。神经症状评分与死亡率统计结果表明,10 mg/kg褪黑素组小鼠与APEC TW-XM感染组无显著性差异;而30 mg/kg褪黑素组和60 mg/kg褪黑素组小鼠神经症状评分与死亡率显著降低（p<0.05）;其中,30 mg/kg褪黑素组和60 mg/kg褪黑素组之间无显著差异。因此选取30 mg/kg作为褪黑素预处理剂量进行后续分析。进一步通过细菌计数、Evans blue、qPCR、ELISA和HE染色等方法分析褪黑素对预防大肠杆菌脑膜炎的作用。结果发现,褪黑素显著降低了 APECTW-XM在小鼠各组织和血液（p<0.01）的载菌量;同时,褪黑素能够显著抑制APEC TW-XM感染诱导小鼠血脑屏障渗透性的增加（p<0.001）、降低脑组织和血清中IL-1β,TNF-α和IL-6的水平以及脑组织中性粒细胞的浸润。以上结果提示,褪黑素能有效抑制APECTW-XM在小鼠体内的定植,保护血脑屏障完整性,抑制炎症的产生和脑组织中性粒细胞的浸润,预防APEC TW-XM感染诱导的脑膜炎。2.褪黑素对APEC TW-XM感染小鼠肠道屏障和肠道菌群的影响。利用二胺氧化酶（Diamine Oxidase,DAO）,异硫氰酸荧光素-右旋糖酐（Fluorescein isothiocyanate-dextran,FITC-dextran）,D-乳酸（D-lactic acid,D-lac）、苏木精-伊红（Hematoxylin-Eosin,HE）染色方法检测以及鲎试剂盒检测体内LPS含量其肠道屏障完整性、qPCR和ELISA检测肠道炎症因子,16S rRNA测序方法分析肠道菌群组成和丰度。检测结果发现APECTW-XM感染的小鼠体内DAO、FITC-dextran、D-lac的含量显著升高,表明APEC TW-XM破坏了小鼠肠道屏障的完整性;同时结肠HE病理进一步验证了 APEC TW-XM感染严重破坏了肠道的结构。然而,褪黑素处理小鼠体内DAO、FITC-dextran、D-lac的含量显著低于APEC TW-XM感染组,同时,结肠HE病理分析表明褪黑素能够保护肠道结构的完整性。结肠炎症因子的检测结果表明,与TW-XM组相比,褪黑素能够显著降低IL-1β（p<0.05）、TNF-α（p<0.05）和IL-6（p<0.05）的表达。内毒素的检测结果展示,与TW-XM组相比,褪黑素显著降低血液以及脑组织中内毒素的含量（p<0.05）。结肠菌群测序的多样性及组成丰度分析发现,APECTW-XM感染降低了厚壁菌门与拟杆菌门比例,提示其扰乱了小鼠肠道内菌群的组成和丰度。而褪黑素预处理能够显著改善小鼠肠道内菌群的组成和丰度变化,降低有害菌丰度的增加以及缓解有益菌丰度的减少。以上结果说明,褪黑素能够有效预防保护APEC TW-XM诱导脑膜炎小鼠肠道屏障完整性和维持肠道内健康菌群的组成和丰度,从而降低脑膜炎小鼠体内内毒素的含量,缓解败血症的发生。3.褪黑素通过调控肠道菌群预防APEC TW-XM感染介导小鼠脑膜炎。通过复合四种抗生素（链霉素（1g/L）、氨苄青霉素（1g/L）、庆大霉素（1 g/L）和万古霉素（0.5 g/L））加到小鼠饮水中构建肠道菌群失调小鼠模型,同时与腹腔注射褪黑素分别处理和共处理小鼠1周,再感染APEC TW-XM。结果显示,与TW-XM+MT组相比,TW-XM+Antibiotic组（APEC TW-XM+抗生素组）脑膜炎发病症状评分和死亡率升高,同时TW-XM+MT+Antibiotic组（APEC TW-XM+Melatonin+抗生素组）小鼠脑膜炎发病时神经症状明显以及存活率显著降低。组织和血液中载菌量检测结果表明,与TW-XM+MT组相比,TW-XM+Antibiotic组和TW-XM+MT+Antibiotic组小鼠体内脑、脾脏、肝脏、心脏、肺脏和血液中的载菌量显著升高（p<0.05）;与TW-XM+MT 组相比,TW-XM+MT+Antibiotic组小鼠血脑屏障渗透性显著升高（p<0.05）。炎症因子的检测结果表明,与TW-XM+MT 组相比,TW-XM+Antibiotic 组和 TW-XM+MT+Antibiotic 组小鼠中脑组织和血清中IL-1β,TNF-α和IL-6的表达显著升高（p<0.05）,且脑组织中伴有大量中性粒细胞浸润。以上结果说明褪黑素需要介导健康肠道菌群来预防APEC TW-XM诱导脑膜炎的发生。4.褪黑素通过调控肠道菌群预防APEC TW-XM感染介导小鼠肠道屏障破坏及肠道菌群变化。与TW-XM+MT组相比,TW-XM+Antibiotic组和TW-XM+MT+Antibiotic 组小鼠体内的 DAO、FITC-dextran、D-lac 水平显著升高（p<0.05）;同时结肠病理分析表明TW-XM+MT+Antibiotic组小鼠结肠结构和形态受到严重破坏;同样地,TW-XM+MT+Antibiotic组小鼠炎症因子IL-1β（p<0.05）、TNF-α（p<0.05）和IL-6（p<0.05）的表达显著高于TW-XM+MT组。内毒素的检测结果表明TW-XM+MT+Antibiotic组小鼠体内内毒素含量显著高于TW-XM+MT 组（p<0.05）。16S rRNA 测序结果分析发现,TW-XM+MT+Antibiotic 组小鼠肠道菌群多样性显著减少。差异菌群分析及肠道微生物结构和丰度的分析结果图中,在门水平上,TW-XM+MT+Antibiotic组优势菌是Proteobacteria,其它主要菌群组成和丰度显著减少;目水平上,TW-XM+MT+Antibiotic组小鼠以Xanthomonadales 为优势菌,显著高于 TW-XM 组,而 Clostridiales,Bacteroidales（p<0.05）和Lactobacillales（p<0.05）相对丰度明显少于TW-XM组。属水平上,TW-XM+MT+Antibiotic组的优势菌是Stenotrophomonas,而Lactobacillus、Bacteroides和Alloprevotella相对丰度显著少于TW-XM组。种水平上,TW-XM+MT+Antibiotic组小鼠中Bacteroidesvulgatus,Lactobacillusreuteri和Lactobacillus intestinalis的相对丰度极显著少于TW-XM+MT组,虽然与TW-XM组的丰度相比无显著性差异,但丰度仍明显是减少的。以上结果表明,褪黑素主要通过调控肠道菌群来缓减APECTW-XM感染介导的肠道损伤,进而保护小鼠APEC TW-XM介导的脑膜炎。综上所述,褪黑素能够有效预防APECTW-XM感染小鼠所诱导的脑膜炎的发病,其作用可能是通过介导肠道菌群来保护脑膜炎小鼠肠道屏障的完整性,降低体内内毒素含量,从而缓解败血症的发生而发挥预防保护作用。