人乳寡糖（HMOs）是母乳中的活性成分之一，具有促进婴幼儿神经发育、免疫调节及肠道菌群平衡维持等功能。但HMOs包含有不同种类的寡糖分子，且相同分子量寡糖的多种同分异构体混合存在，阻碍了不同寡糖单体结构与功能关系的研究。因此，有必要建立一种能够分离制备人乳寡糖单体且能保留其天然结构的方法。
　　本文以麦芽糊精为标准品，基于肼类试剂与还原性寡糖的可逆肼化学反应建立了一种寡糖衍生化分离制备及再生还原性寡糖单体的方法，并且通过此方法，进一步分离经DEAE-52阴离子交换层析柱和石墨碳层析柱获得的中性寡糖与酸性寡糖组分，制备了不同的还原性人乳寡糖单体。最后结合衍生化手段以及质谱检测技术分析了人乳寡糖组成及结构。取得的研究结果如下：
　　1、提出并建立了一种还原性寡糖衍生化分离制备和还原性寡糖单体再生的方法。对于还原性寡糖混合物，在常温弱酸条件下与肼类试剂发生成腙反应，使天然寡糖带上荧光/紫外标签，然后进行高效液相色谱（HPLC）分离，得到分离度较高的寡糖单体组分，寡糖单体组分在弱酸水溶液中70℃反应45min去除荧光标签，再生为还原性寡糖。通过此方法比较了七种肼类试剂对应的还原性寡糖衍生化产率和回收产率，结果表明苯磺酰肼（BSH）是最适合用于后续还原性寡糖单体制备的衍生化试剂，其次为吉拉德试剂P。应用此方法成功制备出14种还原性麦芽糖单体和11种鸡蛋白蛋白N-糖链单体，没有副产物的形成。
　　2、建立了人乳寡糖初步分离纯化的方法。首先利用DEAE-52阴离子层析柱得到中性和酸性寡糖组分、再用石墨碳层析柱从中性寡糖组分中去除乳糖；用透析袋除去酸性寡糖组分中的盐。该方法可简单、快速、高效的将人乳寡糖粗品分离为中性和酸性寡糖组分。此外，基于MALDI-TOF-MS检测技术，结合Girard试剂P与还原性寡糖的靶点衍生化方法和特异性的唾液酸衍生化方法（区分α2,3-和α2,6-连接的唾液酸异构体寡糖）对分离纯化后获得的中性寡糖与酸性寡糖分别进行质谱检测分析。结果显示，成熟乳汁中共存在63条寡糖，其中，中性寡糖共36条，岩藻糖基化的寡糖有28条；酸性寡糖共27条，其中，以α2,3-连接的单唾液酸寡糖共8条，双唾液酸寡糖共2条；以α2,6-连接的单唾液酸寡糖共10条，双唾液酸寡糖共2条；同时被α2,3-唾液酸和α2,6-唾液酸修饰的双唾液酸化寡糖共5条。
　　3、通过还原性寡糖衍生化分离制备、再生的方法分别对中性寡糖和酸性寡糖进一步分离，制备还原性人乳寡糖单体。经HILIC-HPLC分离，共获得10种丰度较高的中性寡糖单体组分，8种酸性寡糖单体组分；分离后获得的10种中性寡糖组分再分别进行PGC-HPLC分离及再生，共获得17种还原性中性寡糖单体组分。这17种寡糖单体组分分别经全甲基化MSn检测分析，共鉴定出19种不同结构的寡糖分子，它们分别为2’-FL、3’-FL、GL、DFL、LNT、LNnT、LNFPⅡ、LNFPⅢ、LNFPⅤ、LNnDFHⅠ、LNnDFⅡ、LNDFⅠ、LNDFⅡ、LNH、MFLNnH、MFLNH、DFpLNnH、DFpLNH和DFLNnH。