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分别从3只藏绵羊和3只山羊全血中提取基因组总DNA,用所设计引物以聚合酶链式反应(PCR)扩增出细胞型朊蛋白(PrP)基因,并克隆到载体.序列分析表明所克隆的各羊PrP基因片段大小为771 bp,包含有羊朊蛋白(PrP)基因的完整编码区序列,为含单一外显子的完整开放阅读框,其与国内外报道的已知序列基本相同.本次所报道的PrP基因含5个短而富含G-C的元件,可编码八肽或九肽.这些PrP基因与参考PrP基因相比较,其核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性分别在99.0~99.9﹪和97.7~99.6﹪之间.共发现16个碱基替换,其中7个为同义码替换、9个为异义突变.异义突变中,除SY01~SY03的S240P外,其余均位于PrP氨基酸91~233的C-端结构区域,分别为MY01的M112T和G129S突变、MY02的T191R突变、MY03的G127S突变及SY02的H143R和R211G.山羊的S240P突变似乎具有品种特异性.将再次PCR扩增的绵羊(Ov)PrP基因目的DNA片段和载体pGEX-4T-1经EcoRI和XholI酶切后连接,转化宿主菌E.coli BL21(DE3).挑选单个菌落,提取重组质粒,经酶切、PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳分析和测序鉴定,成功地构建了2种绵羊重组朊蛋白(Ov rPrP)的表达质粒pMY01[OvrPrP(23~244)]和pMY02[Ov rPrP(91~244)].重组阳性菌用IPTG诱导表达,收集不同培养时间的菌液进行SDS-PAGE和Western blotting.结果在大肠杆菌中分别成功地表达出与预期分子质量50.4 ku和42.9 ku相符的重组蛋白,可被抗牛PrP单克隆抗体4C11所识别,对蛋白酶K敏感,表明成功表达出Ov rPrP(23~244)和Ov rPrP(91~244).经凝胶薄层扫描分析,表达蛋白约占菌体总蛋白的30﹪~45﹪.