尼氏真绥螨TOR基因的表达和功能研究

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尼氏真绥螨Euseius nicholsi是植绥螨的重要种类,且是我国本地优势种,可捕食柑橘全爪螨、蓟马等农业害螨和害虫,是一种重要的捕食性天敌。但该螨目前尚未实现低成本扩繁,只能捕食自然猎物、吸食花粉。一些调控因子如蛋白质和糖类在螨体发育繁殖过程中起到重要作用,昆虫从食物中获得足够的营养以维持自身生殖的需要。雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin,TOR)作为营养信号通路的关键基因,在昆虫的生长发育及繁殖过程中起到重要作用。本研究针对尼氏真绥螨,通过RT-PCR结合RACE技术克隆获得TOR基因全长,并进行生物信息学分析;采用RT-qPCR技术分析了该螨不同发育阶段EnTOR基因及不同营养物质添加处理后EnTOR基因和EnVg基因的mRNA表达水平;RNA干扰探究了尼氏真绥螨EnTOR基因的生物学功能。研究结果为尼氏真绥螨营养介导的TOR信号通路分子机制奠定基础,以期明确其生殖的营养调控机理,为进一步生物防治应用提供理论依据。主要结果如下:1.首次克隆得到尼氏真绥螨EnTOR基因的完整cDNA序列,GenBank登录号:OK665840。获得EnTOR全长序列7999 bp,其ORF(开放阅读框)7491 bp,预测的分子质量和理论等电点分别是283.69 KDa、7.21,共有DUF3385、FAT、FRB、PI3Kc和FATC 5个特异性蛋白质结构域。氨基酸序列比对结果显示,EnTOR基因与同为植绥螨科的西方静走螨Go TOR相似度达到91.95%。此外,系统发育树共包括昆虫纲、蛛形纲和甲壳纲三大支,在蛛形纲分支中,尼氏真绥螨EnTOR与西方静走螨Go TOR首先聚在一起,亲缘关系最近。2.不同营养添加物对尼氏真绥螨TOR及Vg基因的mRNA表达模式分析。通过RT-qPCR技术分析的各发育阶段尼氏真绥螨TOR基因mRNA表达结果显示,在其不同发育阶段均检测到了该基因转录水平的表达;其中雌成螨TOR基因的表达量显著高于卵、幼螨和后若螨(P<0.05),分别是其表达量的6.87、1.34和2.16倍;雌成螨与前若螨的表达量无显著差异(P>0.05)。酵母的添加显著促进了TOR基因在尼氏真绥螨雌成螨中的mRNA表达,而糖的添加对尼氏真绥螨TOR基因的mRNA表达表现出较明显的抑制作用(P<0.05)。添加酵母处理后,前若螨、后若螨和雌成螨TOR基因的mRNA表达量分别是对照组的1.37、21.55和18.25倍。与对照组相比,实验组(花粉+糖、花粉+酵母)EnVg基因在后若螨时期的mRNA表达量升高且差异显著(P<0.05);酵母添加组尼氏真绥螨雌成螨mRNA的表达量显著升高(P<0.05),分别是对照组和糖添加组的2.82、2.32倍。3.尼氏真绥螨TOR基因的生物学功能研究。首次通过饲喂法对尼氏真绥螨雌成螨进行RNAi以探究EnTOR基因的功能。对2日龄的雌成螨饲喂EnTOR基因的dsRNA 48 h后,统计与繁殖相关的参数(产卵历期、产卵量、雌成螨寿命、卵孵化率及干扰后TOR基因和Vg基因的mRNA表达量等)。与对照组相比,当TOR基因受到干扰后,雌成螨产卵历期、产卵量和卵孵化率均显著下降(P<0.05),分别为对照组的52.40%、52.70%和86.80%,而雌成螨寿命虽有降低,但差异不显著(P>0.05)。对尼氏真绥螨雌成螨TOR基因进行干扰后,采用RT-qPCR检测TOR基因和Vg基因的mRNA表达量,发现TOR基因的mRNA表达明显受到抑制,表达量降低47.74%;与对照组相比Vg基因的转录水平也显著降低(P<0.05)。
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