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铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）是一种致病菌。它可以在不同环境中生存,如土壤、空气、创伤伤口以及囊性纤维化（Cystic Fibrosis,CF）病人的肺部。这与其拥有多种毒力因子以及在不同氧气浓度下生存密切相关。铜绿假单胞菌有多种呼吸链可以应对不同的氧环境,而多种末端氧化酶支撑了铜绿假单胞菌具有多种呼吸支链的可能性。因此,呼吸链相关研究将为揭示铜绿假单胞菌适应多种环境提供理论依据。本文在前期研究的基础上,对铜绿假单胞菌PAO1中未知功能的基因PA1548进行了较深入的研究,确定了它在铜绿假单胞菌呼吸链中具有重要的功能。同时,对其影响Cbb3型末端氧化酶（Cbb3-Cox）和毒力因子的分子机理进行了探索。通过氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyte-2H-trazoliumchloride,TTC）还原反应实验和N’-N’-二甲基对甲苯胺氧化实验（NADI反应）发现PA1548突变体（ΔPA1548）中有氧呼吸过程受损,进一步研究揭示这一过程是通过影响Cbb3-Cox的活性完成的。为了探究PA1548如何影响Cbb3-Cox的活性,首先确定其是否影响Cbb3-Cox中亚基的含量。3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMBZ）/SDS-PAGE实验结果显示在ΔPA1548中Cbb3-Cox的Cco O和Cco P亚基含量没有发生变化。将铜绿假单胞菌中的两种Cbb3-Cox（Cbb3-1和Cbb3-2）的整个操纵子分别导入ΔPA1548中并检测其活性,结果显示导入Cbb3-1或者Cbb3-2操纵子的ΔPA1548仍然没有Cbb3-Cox活性。这些结果表明PA1548缺失并不影响胞内Cbb3-Cox的含量。其次,向培养基中外源添加血晶质（Hemin）和Cu SO4发现,在ΔPA1548中添加50μM Cu SO4可以使其Cbb3-Cox的活性恢复。而在ΔPA1548中添加Hemin不会使其Cbb3-Cox的活性恢复。进一步为了探索PA1548与Cu的相关性,本论文将PA1548蛋白进行纯化并且将其与Cu SO4按照摩尔浓度比为1:1、1:5的比率进行温育后测定其荧光光谱的变化。结果显示只有在PA1548蛋白中加入Cu SO4时,该复合物的荧光强度才会减弱。然而电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）结果显示,相对PAO1,ΔPA1548中胞内Cu含量没有发生变化。这些结果表明,PA1548只影响Cbb3-Cox中Cu的获取,对胞内Cu的平衡无影响。上述结果表明PA1548会通过Cbb3-Cox而影响有氧呼吸。为了更进一步探索PA1548对铜绿假单胞菌中呼吸链的影响,本论文也检测了PA1548对反硝化呼吸的影响。测定发现ΔPA1548培养基中剩余NO2-含量增多,胞内产生的NO较少。基于此结果,本论文在ΔPA1548中检测了与反硝化呼吸相关酶的基因的表达情况。结果显示,这些基因的表达在ΔPA1548中有显著的下降。然而anr可以通过dnr和双组分系统nar XL对反硝化呼吸相关酶的基因的表达进行调控,因此本论文检测了ΔPA1548中anr、dnr和nar XL的表达。结果显示,PA1548可以通过降低anr的表达,对dnr和nar XL进行调控,从而影响反硝化呼吸中酶的表达。上述结果表明在铜绿假单胞菌中PA1548会对有氧呼吸和无氧呼吸有重要的影响。且在该菌中与氧化还原相关的毒力因子包括绿脓菌素和铁载体。因此首先探索了PA1548对绿脓菌素的影响机制。结果显示,Δcbb3中绿脓菌素的含量与ΔPA1548相同,约为PAO1的10%。结果表明PA1548可能通过Cbb3-Cox而影响绿脓菌素的产生。在磁螺菌（Magnetospirillum gryphiswaldense）中Cbb3-Cox可以影响胞内的氧化还原平衡,且在铜绿假单胞菌中,编码氧化还原缓冲剂（Glutathione,GSH）的基因gsh A缺失后会使绿脓菌素的产量降低。因此测定了ΔPA1548中NAD与NADH的比率,发现该比率在ΔPA1548中上升。进一步将gsh A导入ΔPA1548中发现,ΔPA1548中绿脓菌素含量有显著的提升但不能恢复到PAO1的水平。结果表明ΔPA1548中绿脓菌素下降的部分原因是通过Cbb3-Cox改变了胞内的氧化还原状态而引起的。其次本论文检测了ΔPA1548中两类铁载体（pyoverdine和pyochelin）的含量发现,相对于PAO1,ΔPA1548中pyoverdine的含量降低,pyochelin的含量升高。而Δcbb3中pyoverdine和pyochelin的含量与PAO1相同。结果表明PA1548对铁载体的影响与Cbb3-Cox无关。上述结果表明PA1548对绿脓菌素和pyoverdine都具有影响。因此最后本论文构建了PA1551-PA1547的报道菌株以筛选能够抑制该基因表达的物质。筛选出石榴皮、青葙子的提取物以及单宁酸可以抑制PA1551-PA1547的表达。总而言之,本论文明确了PA1548与呼吸链、绿脓菌素和pyoverdine的关系,并以该基因为靶标筛选出能够抑制其表达的物质,为今后治疗铜绿假单胞菌的感染提供理论依据。