背景和目的： 原癌基因和抑癌基因是在细胞，生长过程中扮演者重要角色的两大类基因。而原癌基因HER2的扩增是与乳腺癌相关的基因表达中最常见的改变。HER2基因位于17号染色体，编码一种跨膜的具有酪氨酸激酶活性的生长因子受体。在乳腺浸润性导管癌中HER2基因扩增或蛋白过表达的发生率约为20％～30％。有研究表明HER2基因扩增或蛋白过表达不仅是重要的与乳腺癌不良预后相关生物学标记，而且是对乳腺癌化疗及内分泌治疗反应具有指导作用的生物学标记，虽然关于HER2能否作为确实可行的预后指标尚有不同的观点，然而对HER2表达状态的检测已成为最佳化乳腺癌治疗方案的重要步骤。免疫组化(IHC)和荧光原位杂交(FISH)已成为检测HER2表达状态的两种最常用的方法。而且均被国内和国际的治疗指南所推崇但究竟谁是检测HER2表达状态最佳的方法？是IHC的蛋白检测法？还是FISH的基因检测法？ 因此，本课题的目的之一是在当地的人群中前瞻性的研究乳腺癌患者关于HER2状态检测的FISH和IHC两种方法的相关性以及乳腺癌HER2基因表达与乳腺癌临床预后因素、激素受体表达的关系。为关于HER2基因在乳癌患者中表达比例的流行病学资料提供一些数据，为临床推广建立FISH检测奠定一定的基础。 在浸润性乳腺癌病例中常常伴随着17号染色体拷贝数的异常改变，其拷贝数可通过常规的遗传学方法和FISH检测来判断。而这种改变常常影响到HER2基因的扩增和蛋白的表达。Watters和他的同事发现17号染色体拷贝数的异常改变与组织分级III和ER阴性的的病例相关，但对生存期无明显影响；另有研究提示17号染色体拷贝数的异常改变与乳腺癌不良预后因素相关。 因此，本课题的目的之二是当地的人群中研究乳腺癌患者17号染色体非整体性的发生率；分析17号染色体倍体性与HER2基因表达及HER2蛋白表达的相关性。以及17号染色体拷贝数与乳腺癌临床预后因素、激素受体表达的关系。为探讨17号染色体倍体性这一遗传特征与乳腺癌生物学行为及预后的关系提供依据，进而为综合评估乳腺癌预后提供参考指标。 MicroRNA简称miRNAs是生物体内固有的单链、非蛋白编码的长约22 nt的小分子RNA，它们主要通过与靶mRNA的结合以转录后的方式调控着基因表达，成熟miRNAs通过其5’第2-8个核苷酸(种子序列)与它们的靶mRNAs的3’-UTR内的互补位点结合而识别其靶mRNAs，通过使其靶mRNAs的翻译抑制或降解来抑制基因表达，它们己成为基因表达的重要调节因子。功能学研究表明miRNAs参与调控着细胞的增殖、分化和死亡。有研究提示，在肿瘤细胞中miRNAs存在着异常的表达或突变，这表明miRNAs可能成为一类新的原癌基因或抑癌基因。鉴于miRNAs在肿瘤疾病发生发展的作用，通过干预肿瘤细胞内miRNAs的水平来进行肿瘤的治疗的策略逐渐形成。就与HER2基因相关的miRNAs而言，有研究提示在小叶癌和导管癌HER2阳性和HER2阴性标本的对比中并未发现有miRNAs的异常改变，另一近期的研究表明在193例原发的乳腺癌组织中miRNAs表达谱的测定中未发现特异性的miRNAs与肿瘤分期、血管浸润、Her2表达相关。因此作用于HER2基因的天然miRNAs目前并未有确切的研究结果。在本文中，我们应用生物信息学的方法选定两个不同保守性的与HER23’-UTR有互补结合位点的miRNAs: miR-548d-3p、miR-559，随之应用ThepMIR_REPORTTM miRNAs表达报告载体进行验证，即当特定的miRNAs与重组载体上的目标mRNA结合时，能阻断其蛋白的表达，进而降低其荧光素酶的活性。 因此本课题的目的之三是初步研究miR-559和miR-548d-3p在参与调控HER2基因表达方面的作用，为HER2基因分子靶向治疗提供一定的基础数据。 研究方法： 1.应用免疫组织化学法(IHC)分别检测52例人乳腺癌组织中HER2蛋白、ER蛋白、PR蛋白的表达。应用荧光原位杂交(FISH)的方法检测52例人乳腺癌组织中HER2基因的表达，以及17号染色体的表达。 2.收集乳腺癌病例的临床资料：绝经年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、术后分期等。 3.应用统计学方法分析HER2基因与HER2蛋白、预后因素、激素受体表达的关系；分析17号染色体倍体性与HER2基因、HER2蛋白，预后因素、激素受体表达的关系。 4.用生物信息学的方法预测与HER23’-UTR有互补结合位点的miRNAs并计算其自由能(△G):本课题中通过生物信息学的方法，选取miR-559和m1R-548d-3p作为我们的目的miRNAs。采用mFold Software分析HER23’-UTR与miR-559、miR-548-3p互补结合位点5’端与3’端各70个核苷酸序列的自由能，从而预测此位点的可接近性。 5.重组质粒的构建：将618bp的HER23’-UTR的基因序列；611bp的缺失了miR-559种子位点(TTACTTT)的HER23-UTR基因序列；611bp的缺失了miR-548-3p种子位点(GTTTTTA)的HER23-UTR基因序列亚克隆到pMIR-Luc载体中荧光素酶基因开放阅读框的下游，并通过测序来验证其方向性和正确性。 6.转染和荧光素酶活性的检测：上述不同的重组载体与β-gal对照载体，以及相应浓度的不同的miRNAs前体一同转染入Hela细胞，不同的miRNAs前体包括阴性对照前体、m1R-559前体、miR-548d-3p或m1R-559加上-548d-3p前体；转染后48小时检测荧光素酶活性。 研究结论： 1.52例患者中HER2基因过表达的比例为38％。 2.HER蛋白IHC检测和HER2基因FISH法总体上具有明显的相关性，但在IHC2+的情况存在结果不一致的现象，而对于IHC2+的患者应进一步作FISH检测以明确诊断。 3.HER2扩增与乳腺癌不良预后指标有密切相关。 4.52例样本中乳腺癌非整体性的比例约为44％。 5.17号染色体的表达水平分别与HER2基因及蛋白表达水平呈正相关。 6.17号染色体的表达水平的增高与乳腺癌不良预后指标有密切相关。 7.miR-548d-3p和miR-559两个miRNAs均能分别与HER2基因的mRNA的3-UTR起到特异性的识别和结合作用，进而翻译抑制重组载体荧光素酶蛋白的表达，降低荧光素酶的活性，且其效力与转染的miRNAs前体的浓度呈正相关。而miR-548d-3p和miR-559两个miRNAs联合共转染后明显地表现出高于其中一个单独转染的协同地翻译抑制作用。由此初步证实miR-548d-3p和miR-559参与HER2基因的调控，为进一步研究探索抑制或阻断HER2基因表达的分子靶向治疗提供理论和实践的数据。