免疫毒素是一种由靶向部分连接毒素部分组成的融合蛋白。其中,靶向部分通常是抗体、抗体片段或生长因子等具有导向功能的生物活性分子,能够通过特异性识别细胞表面的受体将毒素部分靶向传递至病变细胞。毒素部分普遍具有较强的细胞毒性,通过受体介导进入细胞后,可以发挥杀灭病变细胞的功能。根据来源不同划分,毒素部分可以来自微生物、植物、昆虫和动物等。绿脓杆菌外毒素和白喉毒素是两种获得广泛研究的细菌毒素,目前已有相应的药品Lumoxiti和Ontak被批准上市,对许多不同类型的血液瘤具有明显的治疗效果。然而,临床上广泛应用免疫毒素还存在许多待解决的问题,例如,免疫毒素存在免疫原性、非特异性毒性和低渗透性等。免疫毒素的非特异性毒性主要来源于两部分,一部分是由于毒素分子与内皮细胞的非特异性结合,对内皮细胞的损伤导致血管渗漏综合征的发生;另一部分则是靶向部分与表达肿瘤相关抗原的正常细胞非特异性结合,对正常组织的损伤引发对机体的毒副作用。由于毒素本身的异源性以及肿瘤特异性抗原极少存在,所以免疫毒素的非特异性毒性问题较难解决,于是我们设计新型的免疫毒素,分别对传统免疫毒素的毒素部分和靶向部分进行修饰与改造,从而降低免疫毒素的非特异性毒性。本课题针对靶向表皮生长因子受体2的免疫毒素scFvPE38进行改造,首次设计并制备无毒性两段式免疫毒素。断裂型内含肽是一种能够自我剪切并将两侧蛋白（外显肽）以天然共价键进行连接的自处理功能序列。我们借助断裂型内含肽将免疫毒素分成两段,两段分别与断裂型内含肽融合,在到达靶细胞后,通过控制反应条件,发生内含肽介导的蛋白反式剪接反应,使两段式免疫毒素重新连接形成完整免疫毒素。实验表明,两段式免疫毒素均不具有毒素活性,即使在高浓度条件下,也不会产生细胞毒性。两段式免疫毒素可以在还原性条件下发生内含肽介导的反式蛋白剪接反应,生成完整免疫毒素,并且恢复免疫毒素的细胞毒性,通过受体介导的内吞入胞后,引起靶细胞的凋亡。本课题同时设计新型的抗原屏蔽型免疫毒素M-Fab-PE24,通过连接抗原屏蔽肽至免疫毒素的靶向部分,降低免疫毒素对表达肿瘤相关抗原的正常组织产生的非特异性毒性。在免疫毒素Fab部分的轻链N端通过酶解型连接肽连接抗原屏蔽肽,屏蔽抗体的抗原结合位点,在循环过程中降低免疫毒素对正常组织的结合。在达到肿瘤部位后,接受肿瘤微环境特异性蛋白酶处理,切除屏蔽肽,释放Fab的抗原结合部位,恢复其抗原结合亲和力,选择性对肿瘤细胞发挥杀伤作用。本课题分别从体外和体内验证了抗原屏蔽型免疫毒素的抗原亲和力和生物活性。体外研究结果显示,抗原屏蔽型免疫毒素的抗原结合能力和细胞毒性明显下降,但在接受特定蛋白酶活化后,能够恢复原有的结合亲和力和细胞毒性;使用小鼠异种移植瘤模型进行药效研究显示,抗原屏蔽型免疫毒素M-Fab-PE24具有明显的抑瘤效果,并且与未屏蔽型免疫毒素Fab-PE24相比,对肝脏的损伤较轻,显示出更好的安全性。本课题设计的两种新型免疫毒素分别从1)降低细胞毒性与肿瘤靶位定点恢复以及2)抑制抗原结合能力与肿瘤靶位定点恢复两个方面来研究降低免疫毒素非特异性毒性的通用方法,使其可以用于不同抗体和毒素的任意组合,而不用局限于毒素的来源以及抗原的特异性表达。对以上两种新型免疫毒素的研究,为降低免疫毒素非特异毒性建立了一定的基础,有助于推动免疫毒素广泛应用于临床。本论文首创的新型低非特异性毒性免疫毒素的设计具有较高的开发应用价值。