【摘 要】
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研究目的:本研究拟通过斑马鱼模型及细胞学实验研究JAG1对肠神经系统（Enteric nervous system,ENS）发育形成的影响及具体机制。明确JAG1是否可以通过Notch通路影响肠神经前体细胞的增殖和迁移,进而影响ENS的形成和先天性巨结肠的发生,以期为进一步了解先天性巨结肠的发病机制提供新方向。研究方法:首先在正常小鼠结肠及非先天性巨结肠患儿结肠标本中验证JAG1蛋白的表达情况,并
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.31471190）；
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研究目的:本研究拟通过斑马鱼模型及细胞学实验研究JAG1对肠神经系统（Enteric nervous system,ENS）发育形成的影响及具体机制。明确JAG1是否可以通过Notch通路影响肠神经前体细胞的增殖和迁移,进而影响ENS的形成和先天性巨结肠的发生,以期为进一步了解先天性巨结肠的发病机制提供新方向。研究方法:首先在正常小鼠结肠及非先天性巨结肠患儿结肠标本中验证JAG1蛋白的表达情况,并与胚鼠（E15天）肠管的JAG1蛋白表达情况比较;然后分别获取不同发育阶段的胚鼠肠管（E11.5d,E13.5d,E15.5d）,通过q RT-PCR法检测Jag1及Notch通路信号分子表达量。再构建JAG1-Splicing-Morpholino探针降低斑马鱼jag1 m RNA的表达量,用免疫荧光染色法标记成熟神经元特异蛋白Hu,观察斑马鱼肠神经发育情况,明确JAG1对肠神经发育的影响。另外再获取胚鼠（E16.5天）的肠管进行原代细胞培养获得肠神经前体细胞,分别利用JAG1 Si RNA,JAG1重组蛋白,DAPT（Notch通路抑制剂）对其进行干扰,比较不同处理组间肠神经前体细胞在细胞迁移能力（Transwell实验）、细胞增殖水平（EDU染色）和Notch通路相关信号分子表达量改变情况（q RT-PCR法）,明确JAG1影响肠神经发育的具体机制。研究结果:1.在正常人和小鼠结肠组织中,肌间神经丛和粘膜下神经丛未见JAG1蛋白表达,间质表达少量JAG1蛋白;E15天的胚鼠肠管见JAG1着色范围弥散,着色较浅,部分与PGP9.5重叠。2.肠神经发育过程中,Notch各信号分子动态表达:Jag1、Notch1、Sox10在E11.5天时的表达量低于E13.5天和E15.5天;Dll1、Hes1、Mash1的表达水平在三个时间段逐渐升高;Hey1和GDNF的表达水平则在E13.5天时达到最大值。3.用JAG1-Splicing Morpholino降低斑马鱼jag1 m RNA表达量,发现部分肠管远端出现Hu蛋白染色缺失,部分斑马鱼全肠管均未见Hu蛋白染色。4.使用肠神经前体细胞作为模型的细胞学实验证实JAG1可以抑制Hey-1和Mash-1的表达,并促进肠神经前体细胞的增殖和迁移能力,该过程可被Notch通路抑制剂DAPT阻断;而抑制JAG1的表达造成Hey-1与Mash-1的表达量升高。研究结论:1.JAG1蛋白只在发育过程中的部分肠神经细胞上表达,在肠神经系统成熟阶段JAG1蛋白不表达;Jag1等Notch通路各信号分子m RNA在胚胎肠管发育过程中表达量动态变化,提示Notch信号通路可能动态参与肠神经系统发育的调节过程2.运用JAG1 Splicing Morpholino降低斑马鱼jag1m RNA表达量后见部分斑马鱼全肠管成熟神经节细胞缺失;部分斑马鱼则只在肠管远端出现肠神经细胞缺失,提示JAG1参与肠神经系统发育的调控过程,其信号表达量降低可以造成肠神经系统发育异常3.JAG1可以通过Notch信号通路抑制Hey-1和Mash-1的表达,并促进肠神经前体细胞的增殖和迁移能力,而抑制JAG1的表达造成Hey-1与Mash-1的表达量升高,提示JAG1负性调节Hey-1和Mash-1的表达情况,参与先天性巨结肠的发生过程。
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