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研究背景:下咽鳞状细胞癌为东北地区高发的恶性肿瘤之一,占头颈部恶性肿瘤的3%~5%。早期易发生区域性淋巴结转移,患者的5年生存率仅为30%~35%,是一类预后不良的头颈部恶性肿瘤。据统计2020年全球新发下咽癌病例数约为84254例,但死亡病例数却高达38599例,主要原因在于下咽癌起病隐匿,绝大多数患者在就诊时已处于中晚期;且下咽癌恶性程度高、侵袭性强、极易发生颈部淋巴结转移和远处转移。据文献报道,约有60%的下咽癌患者在首诊时就已经出现同侧颈部淋巴结的转移,约40%的患者可出现对侧隐匿性淋巴结转移,甚至有10~30%的患者伴有远处转移。近年来,虽多采用以手术为主的综合治疗,但仍约有50%的下咽癌患者在治疗后1年内出现远处转移,而遗憾的是目前对于下咽癌的发病及转移机制尚不完全清楚。肿瘤微环境（Tumor microenvironment,TME）是肿瘤发生、发展的重要驱动因素,TME中的细胞不仅可以进行“直接对话”,还可通过TME中的多种活性物质进行“间接对话”。肿瘤源性外泌体（Tumor-derived exosome,TDE）是一种由肿瘤细胞以自分泌或旁分泌的方式分泌到TME中的囊泡状小体,在实现TME中细胞间物质转运和信息传递方面发挥着重要作用。由于TDE内含有多种来源于肿瘤细胞的遗传物质（如蛋白质及核酸等）,故其可通过激活多种信号通路改变靶细胞生理状态,参与肿瘤内部血管形成、肿瘤免疫逃逸和机体代谢等生物学过程,进而帮助肿瘤发生、发展。肿瘤新生血管形成是肿瘤发生、发展的关键因素。现阶段研究证明TDE可参与肿瘤细胞和血管内皮细胞之间的遗传信息交换,促进肿瘤新生血管形成,进而帮助肿瘤进展。另有研究发现,TDE中所含的微小RNA（Micro RNA,miRNA）、环状RNA、长链非编码RNA具有不同的生物学特性和靶向特异性,其表达水平与肿瘤的发生、发展密切相关。因此,深入探讨下咽癌源性外泌体中的miRNA在下咽癌新生血管形成中的具体作用机制对下咽癌的诊断、治疗及预后评估具有重要意义。miR-30b-5p是miR-30b家族中的一员,由miR-30b的前体剪切后形成,作为血管形成相关miRNA调控新生血管的形成。随着基因芯片、高通量测序等技术手段的应用,越来越多的研究发现miR-30b-5p在肿瘤组织与癌旁组织中存在显著的差异性表达,但这种差异性表达在不同肿瘤中并不相同。在肾透明细胞癌中miR-30b-5p呈高表达且为预后不良的独立预测因子;在三阴性乳腺癌中,高表达的miR-30b-5p则促进了肿瘤的转移。而在食管鳞状细胞癌及肝细胞癌中,miR-30b-5p在肿瘤组织中的表达水平明显低于癌旁组织,并与肿瘤的病理分期及转移呈负相关。有研究发现miR-30b-5p在下咽癌患者中呈高表达,并可作为下咽癌患者生存期预测的独立因子,然而其作用机制目前尚未阐明。因此,深入研究下咽癌源性外泌体中的miR-30b-5p与下咽癌新生血管形成的关系有望为下咽癌的发病机制提供新的理论基础。研究目的:本研究旨在阐明下咽癌FaDu细胞系源性外泌体携带的miR-30b-5p与肿瘤新生血管形成之间的联系,为下咽癌FaDu细胞系源性外泌体携带的miR-30b-5p通过调控肿瘤新生血管形成促进下咽癌的发生、发展提供科学依据,并为预测下咽癌不良预后及开发新的治疗靶点提供理论依据。研究方法1.下咽癌源性外泌体对血管形成的影响（1）下咽癌FaDu细胞系源性外泌体的提取及鉴定利用超速离心法提取下咽癌FaDu细胞上清液中的外泌体（以下简称FaDuExo）,随后通过透射电镜鉴定提取物形态;NTA粒径分析实验检测提取物的直径;Western blot实验检测提取物表面标志蛋白的表达情况。（2）FaDu-Exo可被人微血管内皮细胞（HMEC-1）摄取将Exo Glow-Membrane标记的FaDu-Exo与HMEC-1细胞共孵育12h后,通过共聚焦显微镜观察HMEC-1细胞对FaDu-Exo的摄取情况。（3）FaDu-Exo对HMEC-1细胞功能的影响将不同浓度的FaDu-Exo与HMEC-1细胞共孵育,酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测不同浓度FaDu-Exo对HMEC-1细胞分泌血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）的影响;细胞计数试剂盒-8（Cell counting kit-8,CCK-8）实验检测不同浓度FaDu-Exo对HMEC-1细胞增殖能力的影响;Transwell实验检测不同浓度FaDu-Exo对HMEC-1细胞迁移能力的影响;成管实验检测不同浓度FaDu-Exo对HMEC-1细胞体外形成管状结构的影响。2.miR-30b-5p在下咽癌中的表达情况首先对miR-30b-5p表达水平与临床病理特征的相关性进行分析,随后应用Kaplan-Meier方法绘制患者生存曲线,最后检测miR-30b-5p在下咽癌肿瘤组织、FaDu细胞系及FaDu-Exo中的表达情况。3.FaDu-Exo中miR-30b-5p（以下简称FaDu-Exo-miR-30b-5p）对血管形成的影响（1）FaDu-Exo-miR-30b-5p对HMEC-1细胞中miR-30b-5p（以下简称HMEC-1-miR-30b-5p）表达水平的影响利用RT-qPCR实验检测转染miR-30b-5p模拟物（以下简称miR-30b-5p mimic）和抑制物（以下简称miR-30b-5p inhibitor）的FaDu细胞及其外泌体中miR-30b-5p的表达情况;随后,将转染细胞株来源的外泌体（以下简称:FaDu-Exo-miR-30b-5p mimic和FaDu-Exo-miR-30b-5p inhibitor）分别与HMEC-1共孵育,利用RT-qPCR实验检测HMEC-1-miR-30b-5p的表达情况。（2）FaDu-Exo-miR-30b-5p促进HMEC-1细胞的增殖、迁移及血管形成ELISA实验检测FaDu-Exo-miR-30b-5p对HMEC-1细胞分泌功能的影响;CCK-8实验检测其对HMEC-1细胞生长的影响;Transwell实验检测其对HMEC-1细胞迁移功能的影响;成管实验检测其对HMEC-1细胞体外管状结构形成能力的影响。4.FaDu-Exo-miR-30b-5p轴调控血管形成的机制（1）筛选miR-30b-5p下游靶基因——PTEN利用Target Scan、Star Base、DIANA以及mir DIP数据库预测miR-30b-5p的下游基因;KEGG通路富集分析miR-30b-5p下游候选基因的相关信号通路;进一步提取特异性候选基因并分析基因间的互作关系;Targetscan数据库及双荧光素酶报告基因实验检测miR-30b-5p与目标基因的mRNA间是否存在特异性结合位点。（2）miR-30b-5p可抑制PTEN的表达利用RT-qPCR实验检测转染miR-30b-5p mimic或inhibitor的HMEC-1细胞中miR-30b-5p的表达情况;RT-qPCR和Western blot实验检测miR-30b-5p对HMEC-1细胞中PTEN（以下简称HMEC-1-PTEN）表达水平的影响;（3）FaDu-Exo-miR-30b-5p可抑制PTEN的表达将FaDu-Exo-miR-30b-5p mimic以及FaDu-Exo-miR-30b-5p inhibitor分别与HMEC-1细胞共孵育,利用Western blot实验检测FaDu-Exo-miR-30b-5p对HMEC-1-PTEN表达水平的影响。建立过表达PTEN的HMEC-1细胞株（以下简称HMEC-1-PTEN mimic）并将其与FaDu-Exo-miR-30b-5p mimic共孵育24h后,利用RT-qPCR及Western blot实验检测FaDu-Exo-miR-30b-5p mimic在mRNA和蛋白质水平上对HMEC-1-PTEN表达的影响。（4）FaDu-Exo-miR-30b-5p通过抑制PTEN表达促进血管形成将FaDu-Exo-miR-30b-5p mimic与HMEC-1-PTEN mimic共孵育,利用ELISA实验检测HMEC-1-PTEN mimic细胞的分泌功能;CCK-8实验检测细胞增殖能力;Transwell实验检测细胞迁移能力;成管实验检测细胞管状结构形成能力。（5）FaDu-Exo-miR-30b-5p调控PTEN/Akt轴对血管形成的影响STRING数据库预测与PTEN相互作用的基因;KEGG通路富集分析PTEN下游信号通路;Western blot实验检测HSCC组织及癌旁组织中PTEN及其下游通路相关蛋白的表达情况。Western blot实验检测HMEC-1-miR-30b-5p、FaDuExo-miR-30b-5p以及Akt抑制剂对PTEN、Akt通路相关蛋白表达的影响;ELISA实验检测FaDu-Exo-miR-30b-5p对加入Akt抑制剂（GDC0068）的HMEC-1（以下简称HMEC-1-Akt inhibitor）细胞分泌功能的影响;CCK-8实验检测其对HMEC-1-Akt inhibitor细胞增殖能力的影响;Transwell实验检测其对HMEC-1-Akt inhibitor细胞迁移功能的影响;成管实验检测其对HMEC-1-Akt inhibitor细胞体外管状结构形成能力的影响。（6）FaDu-Exo-miR-30b-5p调控PTEN/Akt轴对肿瘤生长及新生血管形成的影响建立下咽癌裸鼠移植瘤模型后将其随机分为9组,分别给予sh-PTEN和（或）过表达/沉默miR-30b-5p的FaDu-Exo（以下简称FaDu-Exo-miR-30b-5p agomir/FaDu-Exo-miR-30b-5p antagomir）。每3天测量一次肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。RT-qPCR实验检测肿瘤组织中miR-30b-5p的表达情况。Western blot实验检测肿瘤组织中PTEN及Akt通路相关蛋白的表达情况;免疫组织化学染色检测肿瘤组织中血管形成情况。研究结果:1.下咽癌源性外泌体对血管形成的影响（1）下咽癌FaDu细胞系源性外泌体的提取及鉴定透射电镜下观察到呈“圆盘状”的囊泡样物,囊泡样物具有膜结构且中心呈低电子密度;NTA粒径分析提示囊泡样物质直径分布在50nm~150nm之间;Western blot实验结果表明囊泡样物质表达了外泌体标志蛋白,但并未表达calnexin蛋白。（2）FaDu-Exo可被HMEC-1细胞摄取共聚焦显微镜下观察到带有红色荧光的FaDu-Exo被带有蓝色荧光的HMEC-1细胞摄取。（3）FaDu-Exo对HMEC-1细胞功能的影响与对照组相比,FaDu-Exo与HMEC-1细胞共孵育的上清液中VEGF的浓度、细胞增殖、迁移以及管状结构形成能力都随着FaDu-Exo浓度的升高而显著增强。2.miR-30b-5p在下咽癌中的表达情况miR-30b-5p与T分期、淋巴结转移情况以及临床分期具有相关性,且高表达miR-30b-5p的下咽癌患者相对预后较差。与癌旁组织相比,miR-30b-5p在肿瘤组织中的表达水平显著升高;与Ha Cat细胞相比,miR-30b-5p在FaDu细胞中的表达水平显著升高;与FaDu细胞相比,miR-30b-5p在FaDu-Exo中的表达水平显著升高。3.FaDu-Exo-miR-30b-5p对血管形成的影响（1）FaDu-Exo-miR-30b-5p对HMEC-1-miR-30b-5p表达水平的影响转染miR-30b-5p mimic的FaDu细胞株高表达miR-30b-5p,而转染miR-30b-5p inhibitor的FaDu细胞株低表达miR-30b-5p,证明转染成功（以下简称FaDumiR-30b-5p mimic和FaDu-miR-30b-5p inhibitor）。与对照组相比,FaDu-miR-30b-5p mimic细胞来源外泌体中高表达miR-30b-5p,而FaDu-miR-30b-5p inhibitor细胞来源外泌体中miR-30b-5p的表达水平显著下调。与NC组相比,与FaDu-ExomiR-30b-5p mimic共孵育后,HMEC-1-miR-30b-5p表达显著升高;而与FaDuExo-miR-30b-5p inhibitor共孵育后,HMEC-1-miR-30b-5p表达显著下降。（2）FaDu-Exo-miR-30b-5p促进HMEC-1细胞的增殖、迁移及血管形成与FaDu-Exo-NC mimic组相比,与FaDu-Exo-miR-30b-5p mimic共孵育后,VEGF的分泌量显著升高,HMEC-1细胞增殖能力显著增强,细胞迁移数量显著增加,管状结构数量显著增多。4.FaDu-Exo-miR-30b-5p调控血管形成的机制（1）筛选miR-30b-5p下游靶基因——PTEN生信分析发现miR-30b-5p下游共有1064个候选基因;候选基因通过调控miRNA的功能参与肿瘤的发生、发展;PTEN为候选基因中的核心基因;miR-30b-5p可特异性调控PTEN的表达。（2）miR-30b-5p可抑制PTEN的表达RT-qPCR结果显示,转染miR-30b-5p mimic的HMEC-1细胞株高表达miR-30b-5p,而转染miR-30b-5p inhibitor的HMEC-1细胞株低表达miR-30b-5p,证明转染成功（以下简称HMEC-1-miR-30b-5p mimic和HMEC-1-miR-30b-5p inhibitor）。与对照组相比,在mRNA和蛋白质水平上,HMEC-1-PTEN的表达可因HMEC-1细胞中过表达的miR-30b-5p显著下调,而HMEC-1细胞中miR-30b-5p的沉默可显著上调HMEC-1-PTEN的表达。（3）FaDu-Exo-miR-30b-5p可抑制PTEN的表达Western blot结果表明,与对照组相比,FaDu-Exo-miR-30b-5p mimic显著抑制了HMEC-1-PTEN的表达水平,而FaDu-Exo-miR-30b-5p inhibitor显著上调了HMEC-1-PTEN的表达水平。在HMEC-1-PTEN mimic细胞株中,FaDu-Exo-miR-30b-5p mimic在mRNA和蛋白质水平上均显著抑制了HMEC-1-PTEN的表达。（4）FaDu-Exo-miR-30b-5p抑制PTEN表达促进血管形成与NC组相比,过表达PTEN可显著抑制HMEC-1细胞VEGF的分泌量,同时抑制其增殖、迁移以及管状结构形成能力;而FaDu-Exo-miR-30b-5p mimic则可显著逆转PTEN对上述功能的抑制作用。（5）FaDu-Exo-miR-30b-5p调控PTEN/Akt轴对血管形成的影响PTEN与Akt1存在相互作用关系,并可调控PI3K/Akt信号通路参与肿瘤的调控。与癌旁组织相比,HSCC组织中PTEN的表达显著下调,p-Akt/Akt及VEGFA的表达显著上调,且在高表达miR-30b-5p的HSCC组织中更为显著。与对照组相比,PTEN可逆转HMEC-1-miR-30b-5p mimic对HMEC-1-p-Akt/Akt表达的上调作用;FaDu-Exo-miR-30b-5p mimic显著下调HMEC-1-PTEN的表达,同时显著上调HMEC-1-p-Akt/Akt的表达;FaDu-Exo-miR-30b-5p可逆转Akt抑制剂对HMEC-1-p-Akt/Akt表达的抑制作用。与对照组相比,加入GDC0068后HMEC-1细胞的VEGF分泌量显著减少,细胞增殖力、迁移能力以及管状结构形成能力显著下降;而加入FaDu-Exo-miR-30b-5p mimic后,GDC0068并不能抑制HMEC-1细胞的VEGF分泌量、细胞增殖力、迁移能力以及管状结构形成能力。（6）FaDu-Exo-miR-30b-5p调控PTEN/Akt轴对肿瘤生长及血管形成的影响动物实验结果显示,PTEN表达水平的下降可显著促进小鼠肿瘤生长,而FaDu-Exo-miR-30b-5p antagomir可逆转PTEN表达水平下降所引起的肿瘤生长;与对照组相比,FaDu-Exo-miR-30b-5p antagomir显著上调肿瘤组织中PTEN的表达,并显著下调肿瘤组织中p-Akt/Akt的表达水平;FaDu-Exo-miR-30b-5p agomir显著下调肿瘤组织中PTEN的表达,并显著上调肿瘤组织中p-Akt/Akt的表达水平;PTEN的缺失或FaDu-Exo-miR-30b-5p agomir使肿瘤组织中微血管密度（Microvascular density,MVD）显著增大,但FaDu-Exo-miR-30b-5p antagomir可显著降低肿瘤组织中的MVD。结论:1.FaDu-Exo可促进HMEC-1细胞的增殖、迁移及管状结构形成能力2.miR-30b-5p在HSCC组织、FaDu细胞及FaDu-Exo中表达上调,其表达水平与HSCC患者的T分期、淋巴结转移情况及临床分期具有相关性,且高表达miR-30b-5p的HSCC患者相对预后较差。3.FaDu-Exo-miR-30b-5p通过PTEN/Akt轴促进肿瘤内新生血管形成,并导致下咽癌生长。