球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是广泛用于农林害虫生物防治的昆虫病原真菌,通常无性生殖,寄主范围极广,能适应复杂多样的寄主环境。基于球孢白僵菌的真菌杀虫剂的有效成分是具有完整细胞结构的侵染体,在田间常遭受夏季高温、紫外辐射、化学农药等环境或人为胁迫因而影响田间防效和稳定性。因此,研究揭示调控昆虫病原真菌无性发育、抗逆力及致病力的遗传基础和分子机制,是利用真菌防治害虫的科学基础,对菌株的遗传改良、菌剂生产及合理应用都具有十分重要的意义。本文首次尝试通过构建和分析蛋白组和修饰化蛋白组,以揭示蛋白磷酸化和乙酰化对球孢白僵菌生命活动及生物防治潜能的意义,并通过丝裂素活化蛋白激酶Ste7磷酸化位点与甘露糖转移酶Pmtl及Pmt4乙酰化位点的功能解析,验证磷酸化蛋白组和乙酰化蛋白组的可靠性。主要研究内容和结果摘要如下：Cdc14作为球孢白僵菌细胞信号枢纽的蛋白/磷酸化蛋白组启示 作为二元特异性磷酸酶,Cdc14通过去磷酸化酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸而调控真菌的细胞核行为,在球孢白僵菌已被证明能正向调控胞质分裂、无性发育、多胁迫应答及毒力。应用iTRAQ标记和质谱技术,构建和分析在正常条件下和氧化、高渗及胞壁干扰胁迫下由Cdc14介导的球孢白僵菌定量蛋白组和定量磷酸化蛋白组。结果显示,cdc14缺失严重扰乱细胞内蛋白表达和磷酸化修饰的平衡。在正常条件下,cdc14缺失导致154个蛋白质和86个磷酸化位点显著上调,117个蛋白质和85个磷酸化位点显著下调。在高渗盐NaCl(1 M)、氧化剂H2O2 (3 mM)和胞壁干扰剂刚果红(0.15 mg/mL)的胁迫下,相对于野生株,△cdcl4分别有23、41和79个蛋白质显著上调,63、39和79个蛋白质显著下调；并分别有127、52和105个氨基酸残基的磷酸化水平显著上调,112、47和226个氨基酸残基的磷酸化水平显著下调。差异组学的生物信息学分析显示,Cdc14可通过调控关键蛋白的表达水平和重要激酶／蛋白的磷酸化水平,而响应不同的环境变化。这些蛋白和磷酸化修饰参与许多重要的生物学过程,重点包括碳水化合物代谢、甘油磷脂代谢、MAPK激酶信号通路和DNA重塑等。这些结果表明,球孢白僵菌Cdc14能够正向调节若干蛋白质的表达水平和磷酸化水平,涉及生长发育及多胁迫应答的信号通路,因而在球孢白僵菌的细胞信号网络中起枢纽作用。球孢白僵菌信号传导激酶Ste7及其磷酸化位点的功能解析球孢白僵菌Ste7是连接Fus3/Kss1信号通路的居中激酶,除了存在一对模式酵母中常见的保守磷酸化位点(S216和T220)之外,上述Cdc14介导的磷酸化修饰组还揭示其存在另外4个磷酸化位点(S362、S391、S440及T485)。通过构建和分析ste7的缺失株和回补株以及双位点突变株MS216A/T220A与单位点突变株MS362A、MS440A及MT485A,发现Δste7、MS362A及MfS216A/T220A诸多表型缺陷是一致的,包括在不同碳氮源上严重的生长缺陷和孢子萌发担缺陷、产孢缺陷、多胁迫应答缺陷以完全丧失经体壁侵染昆虫的毒力。这些表型在其余单点突变株中也发生不同程度的缺陷,而回补株的表型都恢复到野生株的水平。通过分析各菌株若干表型相关基因的转录表达发现,中心发育通路中三个关键激活子(brlA、abaA及wetA)、上下游六个转录因子(flbA～D、luG及vosA)以及营养利用调控因子CreA的转录水平,在敲除株及所有点突变株中大多都较野生株显著或剧烈下调,相当吻合其孢子萌发、营养生长、产孢及侵染力方面的缺陷。五个P型N+/K+ATP激酶(enal-5)的转录表达在敲除株和所有点突变株中都剧烈下调,十分吻合它们对NaCl和KCl胁迫的高度敏感性。此外,对主要抗氧化酶系的转录分析显示,胞质MnSOD (sod2)和两个过氧化氢酶(catA和catP)的表达量大幅下调是Δste7、MS362A及MS216A/T220A等突变株抗氧化、耐高温及抗紫外辐射能力减弱的重要原因。结果表明,Ste7及其6个Ser/Thr磷酸化位点对球孢白僵菌碳氮源利用、营养生长、无性循环、多胁迫应答及寄主侵染具有十分重要的意义,其中S216/T220与S362位点的磷酸化修饰对Ste7调控球孢白僵菌生命活动的作用至关重要。因此,Cdc14介导的磷酸化修饰组所揭示的磷酸化蛋白及其修饰位点,对深入研究球孢白僵菌的生命规律和生物防治潜能具有重要参考价值和启示意义。球孢白僵菌赖氨酸乙酰化蛋白组的构建与分析 赖氨酸乙酰化修饰普遍存在于原核和真核生物中,但真菌中目前仅见模式酵母的研究报道。基于抗赖氨酸乙酰化抗体对肽段的富集和LC-MS/MS串联质谱技术分析,首次成功构建了球孢白僵菌的乙酰化蛋白组,从中鉴定出283个乙酰化蛋白的464个赖氨酸乙酰化位点。这些蛋白的乙酰化修饰主要参与基因转录、染色质重塑、蛋白质折叠和糖／脂类代谢等生物学过程。生物信息学分析显示,球孢白僵菌有6个乙酰化模体,其中5个(KacY、KacH、 KacF、FxKac、KacxxxxK及KacW)也见于其它物种,因而是十分保守的,但其特有的模体KacW和17个乙酰化蛋白在酵母中不存在。从鉴定出的乙酰化蛋白中选择两个O-甘露糖转移酶Pmt1和Pmt4的乙酰化位点进行定点突变和表型分析。结果显示,Pmt1的定点突变K88R或K482R对分生孢子形成、氧化胁迫应答、胞壁干扰胁迫答应和致病力的影响等同或胜过Pmtl的功能缺失,而Pmt4的定点突变K360R具有一定的保生长、稳产孢、抗氧化、抗胞壁干扰及促致病的作用。因此,K88和K482两个Pmt1位点的乙酰化修饰是Pmt1维持球孢白僵菌正常产孢、氧化及胞壁胁迫应答和正常侵染力所必需的。Pmt4的K360乙酰化修饰是稳定球孢白僵菌生长发育、胁迫耐受力及侵染力所需要的。这些结果说明蛋白乙酰化修饰在球孢白僵菌生命活动中的重要作用,由此验证了球孢白僵菌乙酰化修饰蛋白组的有效性和可利用性。