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本研究以枯草芽孢杆菌368(核黄素高产菌株)为研究对象,对直接影响其核黄素产量的3类基因进行了克隆和测序。结果发现:该菌株的核黄素高产原因与ribC基因编码区中的一个点突变有关,该突变词以导致它所编码的黄素激酶活性大幅度下降,黄素激酶活性的下降一方面可以降低核黄素在代谢途径中的进一步转化率,增加核黄素的积累;另一方面还可以降低细胞中的FMN(黄素单核苷酸)、FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)水平,而FMN、FAD水平的下降又可以进一步提高核黄素操纵子(rib operon)以及核黄素转运蛋白(ypaA)的表达量,从而有利于核黄素的生成与对外运输,增加该菌株的核黄素产量。另外我们对枯草芽孢杆菌中的核黄素操纵子做了进一步的优化和改造,主要包括:调控序列的去除、外源强启动子spol的加入、原启动子的去除以及四环素抗性基因的加入等。分析比较了它们在不同大肠杆菌中的游离表达情况,尝试以大肠杆菌为出发菌株进行核黄素高产工程菌株的构建。结果表明:去掉rib operon中原有的第一个启动子和表达调控序列,并加入一个外源强启动子spol时,核黄素合成基在的表达量可以得到明显的提高。当以100μg/ml的氨苄青霉素为选择压力时在宿主菌JM109中的核黄素产量可以达到86μg,/ml(摇床水平);当加入四环素抗性标记基因并以20μg/ml的四环素为选择压力时其核黄素产量可以达到108μg/ml(摇床水平),与未经改造的rib operon相比其核黄素产量提高了10倍。最后本研究对枯草芽孢杆菌的转化方法做了进一步的摸索和优化,用甘氦酸培养结合电转法可以使枯草芽孢杆菌ISW1214(模式菌株)的转化效率达到1.5×10~4,明显高于其它方法。另外通过构建整合型载体将优化好的rib operon转入到枯草芽孢杆菌ISW1214中,并检测分析了外源基因的整合及表达情况。该研究为进一步构建核黄素高产工程菌株奠定了基础。