大肠杆菌广泛存在于自然界及温血动物的肠道内,属于肠道正常菌群。正常情况下并不致病,但当自身的免疫力降低时,会引起严重的疾病。如尿道炎、腹泻、膀胱炎、胆囊炎、阑尾炎、败血症等,是人类重要的条件致病菌。所以抗菌药物的使用仍然是防治大肠埃希菌的主要途径。近年来由于抗菌药物的不合理,不规范使用,导致大肠杆菌的耐药率越来越高。因此构建阿米卡星诱导大肠杆菌的耐药模型以及耐药菌株接合实验,为大肠杆菌耐药提供理论依据。目的本课题通过分析大肠杆菌的耐药谱并进一步用阿米卡星诱导敏感大肠杆菌,以及耐药株接合敏感菌株实验等,通过基因组测序等手段,比较诱导前后菌株的耐药表型变化以及基因的缺失、插入、CRISPR位点有无突变、筛选耐药基因等,从而进一步探讨大肠杆菌对阿米卡星耐药的机制。方法1.大肠杆菌的收集:从洛阳市中心医院检验科收集大肠杆菌63株。2.药敏试验:用纸片扩散法测定大肠杆菌对抗生素的抑菌圈直径,并用微量肉汤法测得所研究抗生素对大肠杆菌的最低抑菌浓度。3.抗生素诱导:用次抑菌浓度的阿米卡星同时诱导4株大肠杆菌耐药。4.无抗生素压力传代培养:对诱导耐药后的4株大肠杆菌在无抗生素的压力下传代培养。5.基因组测序:挑选一株诱导耐药株YDecoli27和诱导前敏感株ecoli27进行二代和三代测序,筛选有无基因的突变、以及CRISPR系统有无发生改变等。6.耐药接合转移实验:对临床耐阿米卡星的耐药株NYecoli、敏感株ecili27进行耐药接合实验,得到接合菌株JHecoli,并对3株菌株进行质粒拼装。结果1.63株大肠埃希菌对青霉素类、喹诺酮类、磺胺类抗生素的耐药率都较高,除头孢西丁外均高于60%;对碳青霉烯类抗生素的耐药率都较低,亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为3.20%和1.60%。通过聚类分析可以分为group1和group2两个组,5个亚群。2.从63株大肠杆菌中检测出4株敏感大肠杆菌,用阿米卡星次抑菌浓度诱导至耐药,终浓度为1024μg/ml。诱导浓度与诱导时间呈正比关系。3.诱导后的菌株除阿米卡星耐药外,阿莫西林、环丙沙星、磺胺异恶唑、头孢曲松均耐药。无抗生素压力传代培养65代,阿米卡星的敏感性恢复。4.对耐药株YDecoli27和敏感株ecoli27测序后,经过比对发现诱导前后有4个基因发生了突变,分别为xylh、yiah,yiaf,yiac。诱导后菌株比诱导前菌株少了16bp,诱导前后菌株无CRISPR位点的突变。5.耐药株上比对到865个基因岛。6.在敏感株ecoli27的质粒上没有检测到耐药基因,接合转移株JHecoli的质粒上检测到多个氨基糖苷类耐药基因。分别是AAC(6’)-Ib-cr、AAC(6’)-Ib9、AAC(6’)-Ib10、AAC(6’)-Ib7、AAC(6’)-IId、AAC(6’)-Ib8、AAC(6’)-Ib’、AAC(6’)-Ib、AAC(6’)-Ib4、AAC(6’)-Ib3、AAC(6’)-Ib’、AAC(6’)-Ib’’、AAC(6’)-Ib11、AAC(6’)-31、APH(3’)-Ia、APH(6)-Id、APH(3’’)-Ib、AAC(3)-IIa、AAC(3)-IIc、AAC(3)-IIe、AAC(3)-IId。并且接合转移后的菌株JHecoli对阿米卡星耐药,说明临床耐阿米卡星菌株的耐药质粒成功接合到JHecoli菌株中。结论携带氨基糖苷类耐药基因的耐药质粒可以通过接合实验使敏感大肠杆菌耐药。